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    骨折愈合期血液中硒蛋白P的表達(dá)及意義研究

    2022-08-02 04:03:48高發(fā)鵬付波于洪濤田銳楊佳霖黃志
    關(guān)鍵詞:骨骼脛骨股骨

    高發(fā)鵬 付波 于洪濤 田銳 楊佳霖 黃志

    骨折是目前常見(jiàn)的骨科疾病之一,同時(shí)也是目前已知愈合時(shí)間較長(zhǎng)的疾病之一[1]。但就目前已知的和臨床常用的促進(jìn)骨折愈合的藥物存在著諸多問(wèn)題[2]。目前約有2.5%~4.0%的患者出現(xiàn)骨折不愈合情況[3]。對(duì)于這種情況目前臨床常見(jiàn)的處理方式是進(jìn)行二次手術(shù),或者是使用促進(jìn)骨折愈合的藥物,但療效仍存在諸多不穩(wěn)定的情況[4]。所以就目前的情況臨床上急需一種可以促進(jìn)骨折愈合,同時(shí)可以降低骨折不愈合發(fā)生的藥物。而硒蛋白P(selenoprotein P,SepP)作為目前已知的較為特殊的一種蛋白質(zhì),在抗炎、抗氧化、抗衰老和抗腫瘤方面具有很重要的作用。但是由于其實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方式不同,導(dǎo)致其在人體中含量測(cè)度存在差異[5]。有研究表明其通過(guò)氧化應(yīng)激的方式可以促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合,為本研究提供思路[6]。所以研究依據(jù)此為思考點(diǎn),探究硒蛋白P與骨折愈合的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    研究所選取的時(shí)間段為2019年5月—2021年10月,研究以10周齡,7只雄性大鼠體重300~400 g [SYXK(黑)2016-014] 的SD大鼠(sprague dawley,SD)大鼠外周血作為實(shí)驗(yàn)樣本,通過(guò)蛋白免疫印跡(westorn blot,WB)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-PCR,RT-PCR)的試驗(yàn)方法分別對(duì)大鼠愈合階段逐步分析硒蛋白P與骨折愈合的關(guān)系。動(dòng)物飼養(yǎng)按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》第8版進(jìn)行飼養(yǎng),14只SD大鼠10周齡,7只雄性大鼠體質(zhì)量300~400 g,平均(354.41±2.45)g,7只雌性大鼠180~270 g,平均(254.41±1.98)g,處死大鼠,分離血清和組織以供進(jìn)一步分析。

    1.2 方法

    RT-PCR收集各組分大鼠的血液樣本。分別提取大鼠的用Trizol試劑提取血液核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)樣本。在無(wú)周圍組織的情況下制備骨骼,并在液氮下使用Mikro二膜機(jī)(B.Braun,Melsungen,德國(guó))在teflon膠囊中用鋼球研磨成粉末。根據(jù)制造商的說(shuō)明,使用TRIzol?試劑(德國(guó)Erlangen PEQLAB)從脛骨和股骨粉末中提取總RNA。RNA樣本于-80℃下保存。反轉(zhuǎn)錄成cDNA文庫(kù)于-20℃下保存,將cDNA通過(guò)PCR反應(yīng)檢驗(yàn)基因表達(dá)情況,引物詳見(jiàn)表1。

    表1

    1.3 Western Blot檢測(cè)蛋白變化

    將樣本取1 μL蛋白樣本與4× Loading buffer,100℃煮樣5 min,晾干后于-20℃分裝凍存。取10 μL蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。分離膠采用10%,濃縮膠采用5%。初始電壓80 V,45 min,調(diào)整電壓至120 V,45 min,停止電泳。拆除電泳裝置,除去濃縮膠部分,切留含目的蛋白的分離膠部分。將濾紙等物品浸泡于轉(zhuǎn)膜液中,將PVDF膜剪去右上角,于甲醛溶液中浸泡激活1 min后放入轉(zhuǎn)膜液備用。合并裝置并按照正負(fù)極正確安裝裝置,連接電源100 V電轉(zhuǎn)100 min。在4℃條件下與一抗(1:1 000)孵育。室溫條件下將PVDF膜與二抗(1:5 000)孵育1 h。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    通過(guò)單向方差分析和費(fèi)羅尼校正(bonferroni correction,Bonferroni校正)多重比較試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估 。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 硒蛋白P受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白8重組蛋白(recombinant low density lipoprotein receptor related protein 8,Lrp8)在缺硒骨中的誘導(dǎo)情況

    SepP及其受體Lrp8在骨骼中表達(dá)。分離、勻漿、SDSPAGE分級(jí)和Western Blot分析具有所示基因型的大鼠股骨。由于硒蛋白轉(zhuǎn)錄本數(shù)量較多,所有硒代謝和硒蛋白生物合成的必要因素也在骨骼中表達(dá)。在已建立的SepP受體中,可檢測(cè)到Lrp8,缺失Lrp2;Lrp8在SepP/大鼠中強(qiáng)烈上調(diào)。對(duì)于第三個(gè)受試Lrp家族成員,即Lrp1,也遵守了類似的規(guī)定。Lrp1是否也有助于SepP的攝取目前還存在爭(zhēng)議。由于已建立SepP和Lrp8以形成組織特異性Seuptake的中央轉(zhuǎn)運(yùn)體-受體對(duì)36,其蛋白質(zhì)表達(dá)通過(guò)Western Blot分析進(jìn)行評(píng)估。SepP在SepP+/+和SepP+/大鼠的股骨中可檢測(cè)到,其條帶遷移速度約為47、45和42 kDa。正如預(yù)期的那樣,SepP的表達(dá)在SepP/大鼠中無(wú)法檢測(cè)到(圖3A)。Lrp8在所有3種SepP基因型的骨骼中檢測(cè)到,其異構(gòu)體在4 130和4 180 kDa遷移(圖3B)。Lrp8在骨骼中的表達(dá)強(qiáng)度幾乎與作為陽(yáng)性對(duì)照組織的睪丸中的表達(dá)強(qiáng)度相似。因此,16塊骨骼為SepP介導(dǎo)的接受器提供了良好的裝備。在組織化學(xué)分析中,SepP可以檢測(cè)到,尤其是在礦化骨中,而軟骨是陰性的(圖3C和D)。具體見(jiàn)圖1所示。

    圖1 SepP受體Lrp8在缺硒骨中的誘導(dǎo)情況

    2.2 骨骼血液中硒蛋白P(SepP)硒的運(yùn)輸情況

    SepP作為骨骼硒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用,(1)-/-組大鼠硒相對(duì)濃度的百分比為(7.33±2.66)%,-/-tg大鼠硒相對(duì)濃度的百分比為(14.59±3.41)%,血清硒在SepP中僅輕微增加-/-tg與SepP的比較-/-大鼠P>0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(2)-/-大鼠股骨硒相對(duì)濃度的百分比為(44.55±4.23)%,-/-tg大鼠股骨硒相對(duì)濃度的百分比為(74.81±7.48)%,-/-大鼠脛骨硒相對(duì)濃度的百分比為(60.81±5.21)%,-/-tg大鼠脛骨硒相對(duì)濃度的百分比為(75.45±7.32)%。-/-大鼠股骨組與-/-tg大鼠股骨組對(duì)比P<0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。-/-大鼠脛骨組與-/-tg大鼠脛骨組對(duì)比P<0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SepP中股骨(陰影條)和脛骨(開(kāi)放條)中的硒濃度顯著增加-/-tg大鼠與SepP大鼠的比較-/- 大鼠在肝細(xì)胞中表達(dá)SepP。并通過(guò)單向方差分析和Bonferroni校正多重比較試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估;(3)在正常情況下,膳食硒被肝細(xì)胞吸收,有效地插入SepP并運(yùn)輸?shù)絻?yōu)先供應(yīng)的靶組織,包括骨骼。嚴(yán)重的硒缺乏或慢性肝病導(dǎo)致SepP缺乏和骨骼中的硒缺乏,導(dǎo)致某些硒蛋白的表達(dá)減少,以及作為骨骼SepP受體的Lrp8代償性上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)將SepP添加到骨健康的重要肝源性因素列表中,并作為肝性骨營(yíng)養(yǎng)不良的潛在補(bǔ)充靶點(diǎn)。具體見(jiàn)圖2所示。

    圖2 骨骼血液中硒蛋白P(SepP)硒的運(yùn)輸情況

    3 討論

    必需微量元素硒(Se)在人類健康中起著重要作用。低硒狀態(tài)與癌癥等高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類研究中均有報(bào)道[7]。死亡率已被證明與危重病和腎癌的血硒濃度呈負(fù)相關(guān),這突出了硒作為一種基本元素的突出重要性微量營(yíng)養(yǎng)素[8-10]。然而,由于硒取決于膳食硒,因此全世界人口的硒狀況差異很大,而膳食硒又受到農(nóng)業(yè)食品生產(chǎn)所用土壤的決定性控制。全球膳食硒攝入量范圍為每天7~220 μg硒,歐洲大部分地區(qū),亞洲和非洲必須被視為自然資源硒供應(yīng)不足的地區(qū)[11-13]。此外,飲食偏好、個(gè)人基因型和一般健康狀況是硒代謝和狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)因素。攝入減少后,血清、肝臟、腎臟和其他組織中的硒濃度下降。值得注意的是,中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌器官在很大程度上對(duì)有限的硒供應(yīng)具有抵抗力。即使在嚴(yán)重缺硒的實(shí)驗(yàn)?zāi)P椭校@些器官仍保持其特有的硒狀態(tài)。在組織水平和不同的硒蛋白方面都觀察到了這種硒狀態(tài)的等級(jí)依賴性,確保即使在嚴(yán)重缺硒的情況下,最基本的硒依賴過(guò)程仍能在特權(quán)組織中維持[14-17]。本研究提出骨折愈合期血液中硒蛋白P的表達(dá)及意義的實(shí)驗(yàn)分析,以此來(lái)進(jìn)一步明確硒蛋白P與骨折愈合期血液之間的表達(dá)及意義,為臨床疾病的治療提供一些參考。

    研究顯示,骨折愈合期血液中,SepP受體Lrp8在缺硒骨中被誘導(dǎo),由于硒蛋白轉(zhuǎn)錄本數(shù)量較多,所有硒代謝和硒蛋白生物合成的必要因素也在骨骼中表達(dá)。在已建立的SepP受體中,Lrp8可檢測(cè)到,Lrp2缺失;Lrp8在SepP中強(qiáng)烈上調(diào)-/- 大鼠。對(duì)于第三個(gè)受試Lrp家族成員,即Lrp1,也觀察到類似的規(guī)定。Lrp1是否也有助于SepP的攝取目前仍存在爭(zhēng)議。由于已建立SepP和Lrp8以形成組織特異性硒攝取的中央轉(zhuǎn)運(yùn)體-受體對(duì),通過(guò)Western Blot分析評(píng)估其蛋白質(zhì)表達(dá)(圖1)。SepP可在SepP+/+和SepP的股骨中檢測(cè)到+/- 在大約47、45和42 kDa遷移帶的大鼠。正如預(yù)期的那樣,SepP在SepP中的表達(dá)是不可檢測(cè)的-/- 大鼠(圖1A)。Lrp8在所有三種SepP基因型的骨骼中都檢測(cè)到,其異構(gòu)體在>130和>180 kDa遷移(圖1B)。Lrp8在骨骼中的表達(dá)強(qiáng)度幾乎與作為陽(yáng)性對(duì)照組織的睪丸中的表達(dá)強(qiáng)度相似。因此,骨骼為SepP介導(dǎo)的硒攝取做好了充分準(zhǔn)備。接下來(lái)測(cè)試了骨骼血液中是否能夠通過(guò)使用循環(huán)SepP有效地增加其硒狀態(tài),即SepP是否將硒從肝臟血液運(yùn)輸?shù)焦趋?。為此,SepP-/-對(duì)僅在肝細(xì)胞中表達(dá)人SepP轉(zhuǎn)基因的大鼠進(jìn)行分析。血清中的硒濃度僅受到轉(zhuǎn)基因的輕微影響(圖2A)。相比之下,SepP的股骨和脛骨中的硒濃度-/-與SepP相比,轉(zhuǎn)基因可有效提高tg-/- 大鼠(圖2B)。值得注意的是,SepP中的骨硒濃度-/-tg大鼠幾乎達(dá)到雜合子SepP水平+/- 大鼠,盡管轉(zhuǎn)基因?qū)ρ逦呢暙I(xiàn)很小。這一發(fā)現(xiàn)表明,通過(guò)肝源性SepP可以有效地將硒轉(zhuǎn)運(yùn)到骨骼中(圖2C)。

    硒主要以硒代半胱氨酸(selenocysteine,Sec)的形式發(fā)揮作用,Sec是第21種蛋白質(zhì)生成氨基酸。Sec依賴性硒蛋白分別由一組25個(gè)人類和24個(gè)大鼠基因編碼。10硒蛋白的生物合成需要在硒蛋白轉(zhuǎn)錄本的開(kāi)放閱讀框內(nèi)重新編碼UGA終止密碼子。Sec與生長(zhǎng)中硒蛋白的共翻譯摻入取決于一組Sec特異性反式和順式作用因子的相互作用,包括Sec負(fù)載的tRNA[Ser]Sec,硒蛋白轉(zhuǎn)錄本中的Sec插入序列(selenocysteine insertion sequenceelement,SECIS)元 件,該元件由限速RNA結(jié)合因子SECIS結(jié)合蛋白-2(SECIS binding protein 2,SBP2)識(shí)別11此外,已經(jīng)描述了參與細(xì)胞內(nèi)硒代謝的兩種硒結(jié)合蛋白,即56 kDa硒結(jié)合蛋白-1(recombinant selenium binding protein 1,SELENBP-1)和14 kDa脂肪酸結(jié)合蛋白-1(human liver fatty acid binding protein,F(xiàn)ABP-1)。在細(xì)胞內(nèi),硒被釋放并還原為硒化物,然后被依賴于硒的磷酸硒合成酶-2(abstract selenophosphate synthetase 2,SEPHS2)磷酸化。同時(shí),磷酸化的絲氨酸t(yī)RNA激酶(pro-teinserine / threoninekinase,PSTK)使絲氨酸負(fù)載的tRNA[Ser]Sec磷酸化。這兩種富含能量的底物結(jié)合到Sec負(fù)載的tRNA[Ser]Sec是由P-Ser-tRNA:SectRNA催化的。Sec特異延伸因子EFsec和核仁蛋白(NCL)最終與其他翻譯因子一起促成Sec的共翻譯插入。

    在哺乳動(dòng)物硒蛋白中,硒蛋白P是獨(dú)特的,因?yàn)樗鼣y帶每個(gè)蛋白質(zhì)的多個(gè)Sec殘基,并構(gòu)成血液中硒的大部分。硒蛋白P決定性地有助于大腦和睪丸的分級(jí)硒供應(yīng)。脂蛋白受體相關(guān)蛋白(lipoprotein receptor associated protein,LRP)的兩個(gè)受體已確定該家族為硒蛋白P受體,即Lrp2和Lrp8。血清硒和硒蛋白P濃度在廣泛的營(yíng)養(yǎng)硒攝入范圍內(nèi)相關(guān)。一旦硒供應(yīng)充足,硒蛋白P生物合成即達(dá)到飽和,從而獨(dú)立于進(jìn)一步的硒攝入。觀察到硒蛋白P最大表達(dá)的閾值用于確定硒的最佳營(yíng)養(yǎng)攝入范圍。在具有改良硒蛋白P表達(dá)的大鼠模型中分析了硒蛋白P的生理作用。純合子硒蛋白P敲除(硒蛋白P-/-)大鼠表現(xiàn)出具有組織特異性硒缺乏、生長(zhǎng)率降低、共濟(jì)失調(diào)和男性特異性不育的硒依賴表型。Lrp8基因敲除大鼠復(fù)制了神經(jīng)表型,突出了大腦硒穩(wěn)態(tài)對(duì)硒蛋白P和Lrp8的相互依賴性。硒對(duì)骨骼的核心重要性正日益被認(rèn)識(shí)。在低膳食硒攝入下,嚙齒類動(dòng)物的骨骼表型以發(fā)育不良的皮質(zhì)和小梁礦化為特征。在人類中,硒缺乏與大骨節(jié)病相關(guān),一種地方性退行性骨關(guān)節(jié)炎,可通過(guò)補(bǔ)充硒預(yù)防?;加蠸BP2遺傳缺陷的受試者表現(xiàn)出硒蛋白表達(dá)減少,血液中甲狀腺激素模式紊亂,骨發(fā)育持續(xù)顯著延遲,身材相對(duì)矮小。最近,筆者報(bào)告血清硒蛋白P濃度與骨轉(zhuǎn)換和骨密度的標(biāo)志物相關(guān)。在研究中,評(píng)估了硒蛋白P對(duì)骨硒代謝的重要性。

    研究結(jié)果表明,骨動(dòng)態(tài)表達(dá)硒蛋白P受體Lrp8,并依賴肝源性硒蛋白P有效攝取硒,因此代表了優(yōu)先供應(yīng)的靶器官在組織特異性硒供應(yīng)層次中居高不下,類似于大腦和經(jīng)典內(nèi)分泌器官?,F(xiàn)有研究分析來(lái)看,這種代謝特權(quán)是完全有道理的,因?yàn)楣趋琅c大腦和內(nèi)分泌器官對(duì)生長(zhǎng)和生存同樣重要。到目前為止,這種對(duì)低細(xì)胞內(nèi)硒水平的代謝反應(yīng)是骨骼所特有的。SepP攝取和細(xì)胞內(nèi)硒代謝的這種動(dòng)態(tài)適應(yīng)是否代表了硒缺乏時(shí)SepP靶組織的更一般機(jī)制,有助于腦和內(nèi)分泌器官等重要組織的分級(jí)供應(yīng),并在硒缺乏時(shí)保護(hù)重要的硒依賴過(guò)程,還有待觀察。

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