干熱河谷不同樹齡攀枝花蘇鐵叢枝菌根真菌多樣性研究

魏玉倩，陳健鑫，鄭艷玲，王 芳，馬煥成*，伍建榕

(1.西南林業(yè)大學 云南省高校森林災害預警控制重點實驗室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學 國家林業(yè)和草原局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224)

攀枝花地區(qū)是典型的干熱河谷地區(qū)，位于26°51′32″N,101°34′46″E，四川省最南部，地處攀西裂谷中南段，夏季長，旱季雨季分明晝夜溫差大，氣候干燥，降雨量集中在雨季[1]。攀枝花蘇鐵國家級自然保護區(qū)位于金沙江北岸的巴關河西坡及格里坪后山，屬于典型的南亞熱帶半干旱河谷氣候類型，冬季氣候溫和，日照充沛，熱量豐富[2]。該地區(qū)地勢陡峭、河谷深切、地形封閉[3]。金沙江干熱河谷森林覆蓋率不足5%，生態(tài)環(huán)境惡劣，水土流失嚴重，植物難以在該地區(qū)建立長期穩(wěn)定的種群。

攀枝花蘇鐵(Cycaspanzhihuaensis)是中國特有的古老孑遺植物，與熊貓、恐龍合稱為“巴蜀三寶”,生存時間長達2億a以上[4]。攀枝花蘇鐵最初發(fā)現(xiàn)于攀枝花市附近的巴關河西坡，繼而在毗鄰的格里坪后山及寧南、德昌、鹽源和云南華坪等縣的局部地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)，是蘇鐵屬在東亞大陸分布緯度最北的種類。攀枝花蘇鐵能適應干旱河谷的特殊生境能在河谷巖壁的石縫中建立自己的種群[5]，為適應外界不良的環(huán)境，攀枝花蘇鐵與土壤微生物建立共生關系，進化出了特殊的根系，包括主根、側根和特化的珊瑚狀根。目前對蘇鐵特殊根系的研究主要集中在由共生藍藻形成的珊瑚狀根上，大多數(shù)研究者認為共生藍藻通過根系的裂縫、水孔、根系頂端及根系分支處開始侵染并延伸至藻胞層定殖[6-8]。研究指出攀枝花蘇鐵根系內生菌有較高的多樣性，Zheng Y等[9]利用高通量技術對攀枝花蘇鐵不同組織和根際土壤中微生物物種多樣性和群落組成進行分析表明，不同組織中的微生物群落均有高度的多樣性；研究表明自然生態(tài)系統(tǒng)中菌根真菌影響植物種群的競爭能力，菌根真菌的多樣性決定著植物的生物多樣性、生態(tài)系統(tǒng)的變化以及植物的生產力[10]。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)隸屬于球囊菌門(Glomeromycota)的一類專性活體營養(yǎng)共生菌，能與陸地生態(tài)系統(tǒng)約80%以上的高等植物形成互惠共生體，通過共生體AMF能促進植物對N、P、K等礦物質元素及微量元素的吸收和利用，增強植物的抗旱、抗寒和鹽脅迫等的抗逆性，促進植物生長、加快幼苗成活、促進農林業(yè)發(fā)展，對生物多樣性的維持和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要的作用[11-12]。AMF主要以菌絲網和孢子的形式定殖于植物根際土壤中，同時以叢枝和泡囊的結構共生于植物根系中[13]，有文獻報道，蘇鐵與AMF也存在共生關系，B.Jack和P.Andrew[14]在南美蘇鐵(Zamiapumila)和雙子鐵(Dioonedule)中描述了存在于根系皮層薄壁細胞的AMF，并提出了當土壤P元素含量受限時，蘇鐵需要AMF才能成功地固N，但攀枝花蘇鐵中是否有AMF定殖還未見報道。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，生長于干旱貧瘠土壤的攀枝花蘇鐵根系土壤有大量的AMF孢子，然而對不同樹齡的AMF定殖情況及群落組成鮮見報道。本研究以不同樹齡的攀枝花蘇鐵根系及根際土壤為研究對象，從攀枝花蘇鐵根際土壤中分離AMF孢子，通過形態(tài)學特征和分子生物學方法進行種類鑒定，并通過醋酸墨水染色法觀察AMF的定殖情況及計算定殖率，統(tǒng)計分析不同樹齡的攀枝花蘇鐵根內及根際土壤中AMF種類及多樣性的變化趨勢，旨在為攀枝花蘇鐵菌根化育苗栽培及保育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2018年7月在四川省攀枝花市攀枝花蘇鐵國家級自然保護區(qū)內，采用五點取樣法[15]，在每點分別采取8株14 a、8 a和3 a樹齡的攀枝花蘇鐵植株，每個植株在東西南北4個方位采集蘇鐵根系及土樣。取根樣時，先用75%乙醇擦拭枝剪，快速剪取須根后保存于FAA固定液中，同時挖取蘇鐵根際土壤，采集距地表5～20 cm的根際土壤1 000 g，裝入無菌塑料袋，帶回實驗室進行后續(xù)試驗。

1.2 根系AMF定殖率的測定

采用醋酸墨水染色方法觀察攀枝花根系菌根真菌定殖狀況。將根樣從FAA固定液中取出，流水緩慢沖洗2～3次后將根系剪成1 cm長的根段，然后將根樣置于20% KOH中透明，置于5%醋酸中酸化，用5%醋酸墨水染色液染色，最后用清水浸泡脫色后即可鏡檢[16]。每個樣品采集50個根段，計算根段定殖率。

根段定殖率參照唐燕等[17]的方法，將AMF定殖強度劃分為強、中、弱3級，強定殖率為76%～100%，中定殖率為25%～75%，弱定殖率為0～24%。根段侵染率的計算公式如下：

根段定殖率(%)=∑(0×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+……+100%×根段數(shù))/總根段數(shù)

(1)

1.3 AMF孢子的分離與密度統(tǒng)計

采用濕篩沉淀法[18]分離土壤中AMF孢子。稱取風干土樣20 g置于250 mL廣口瓶中，將水加至200 mL，用玻璃棒將其充分攪拌混勻，靜置過夜，制備成土壤懸浮液。將懸浮液分別過20、100、140、200、300目的土壤篩，用自來水反復輕柔清洗，直至篩底流出的水澄清為止，將篩面篩出的物質全部轉移至燒杯中，加水至200 mL，靜置20 min后轉入梨形分液漏斗進行沉降除沙，分液漏斗中靜置20 min后，打開活塞，待分液漏斗中所剩溶液為100 mL時，關閉活塞，所得的孢子懸浮液用布氏漏斗進行過濾，經真空抽氣泵抽氣于直徑為9 cm的墊有濾紙的培養(yǎng)皿上，20目的不過濾。并在體式顯微鏡下分別計數(shù)各篩面的孢子數(shù)目，統(tǒng)計每克土樣中含有的AMF孢子的數(shù)量計為AMF孢子密度[19]。

1.4 AMF孢子的鑒定

形態(tài)學鑒定方法：挑取單個AMF孢子置于載玻片上，通過光學顯微鏡觀察并拍照記錄，重點觀察孢子大小、形狀、顏色、連孢菌絲、孢子壁及發(fā)芽壁的層數(shù)和厚度、孢子壓破后的內含物等特征。根據SCHENCK和PEREZ的《VA菌根真菌鑒定手冊》和INVAM(http://invam.caf.wvu.edu)提供的種的描述的圖片進行種屬的檢索和鑒定，并將數(shù)量及相對多度較高的種計為優(yōu)勢種屬。

分子生物學鑒定方法：采用OMEGA公司MicroElute Genomic DNA Kit試劑盒提取單孢子總DNA，參照李小林等[20]的方法，通過巢式PCR擴增AMF 18SrDNA片段。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，正確的擴增產物送昆明擎科生物有限公司進行測序。雙向測通的序列通過DNAman進行拼接并去除兩端低質量序列，通過MEGA 6.0中的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，依此確定菌株的分類地位。

1.5 攀枝花蘇鐵AMF多樣性及不同樹齡間的差異分析

參照包玉英等[21]的方法，采用孢子密度、物種豐富度、優(yōu)勢度、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Simpson生態(tài)優(yōu)勢度來描述攀枝花蘇鐵AMF多樣性，同時分析14年生、8年生和3年生攀枝花蘇鐵AMF的差異性。采用Excel統(tǒng)計試驗數(shù)據，并使用SPSS22.0軟件分析不同樹齡之間的顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 攀枝花蘇鐵根系AMF定殖情況

攀枝花蘇鐵根系染色后的樣本在光學顯微鏡下可見AMF侵染與定殖情況(圖1)，其中菌絲、泡囊是根系內AMF的主要結構。

通過表1數(shù)據統(tǒng)計分析，結果表明，不同樹齡攀枝花蘇鐵的根系AMF定殖情況存在一定差異，14年生攀枝花蘇鐵根系的AMF定殖率最高，達到高定殖強度，定殖結構以泡囊為主(圖1a、圖1b)；8年生根系AMF定殖率中等，為中定殖強度，定殖結構以泡囊和菌絲為主(圖1c、圖1d)；3年生的AMF定殖率較低，為弱定殖強度，定殖結構以菌絲為主，泡囊結構較少(圖1e、圖1f)。

注:a、b為14年生攀枝花蘇鐵；c、d為8年生攀枝花蘇鐵；e、f為3年生攀枝花蘇鐵；V為泡囊；H為菌絲；標尺=20 μm。圖1 攀枝花蘇鐵根系AMF形態(tài)Fig.1 Morphology of AMF in roots of Cycas panzhihuaensis

表1 不同樹齡的攀枝花蘇鐵AMF的定殖情況Table 1 The colonization of AMF in Cycas panzhihuaensis trees with different ages %

2.2 不同樹齡階段的攀枝花蘇鐵AM真菌的鑒定

基于形態(tài)學特征鑒定，攀枝花蘇鐵根際土壤中共分離、鑒定得到6屬22種的AMF孢子(圖2)，包括球囊霉屬(Glomus)、無梗囊霉屬(Acaulospora)、近明球囊霉屬(Claroideoglomus)、斗管囊霉屬(Funneliforms)、盾巨孢囊霉屬 (Scutellospora)、硬囊霉屬(Sclerocystis)。球囊霉屬和無梗囊霉屬為攀枝花蘇鐵根際AMF的優(yōu)勢屬，相對多度分別為56.91%和28.23%。

注:1.黑球囊霉；2.澳大利亞球囊霉；3.蜜色無梗囊霉；4.雙網無梗囊霉；5.黑色盾巨孢囊霉；6.團集球囊霉7.網狀球囊霉；8.近明球囊霉；9.斑點球囊霉10.多梗球囊霉；11.膨果球囊霉；12.地表球囊霉；13.地球囊霉；14.縮球囊霉；15.卷曲球囊霉；16.小果球囊霉；17.黑球囊霉；18.明球囊霉；19.雙網無梗囊霉；20.細凹無梗囊霉；21.幼套近明球囊霉；22.臺灣硬囊霉。圖2 攀枝花蘇鐵根際土壤叢枝菌根真菌孢子形態(tài)Fig.2 The morphology of AMF spores in rhizospheric soils of Cycas panzhihuaensis

由表2可見，3年生攀枝花蘇鐵根系中共鑒定出AMF 3屬，包括球囊霉屬、無梗囊霉屬和盾巨孢囊霉屬。特有菌種為澳大利亞球囊霉(G.australe)、蜜色無梗囊霉(A.mellea)、黑色盾巨孢囊霉(S.nigra)；8年生蘇鐵根系中共鑒定出AMF 4屬，包括球囊霉屬、無梗囊霉屬、近明球囊霉屬和硬囊霉屬。特有菌種為皺壁無梗囊霉(A.rugosa)；14年生蘇鐵根系中共鑒定出AMF 5屬，包括球囊霉屬、無梗囊霉屬、近明球囊霉屬、硬囊霉屬和斗管囊霉屬，特有菌種為細凹無梗囊霉(A.scrobiculata)、幼套近明球囊霉(C.ctunicatum)、摩西斗管囊霉(F.mosseae)。

表2 不同樹齡的攀枝花蘇鐵根際土壤中AMF孢子種類組成Table 2 The community of AMF in rhizophere soil of Cycas panzhihuaensis with different ages

基于分子生物學方法，擴增了AMF單孢子18SrRNA片段，通過鄰接法構建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，共鑒定了9種AMF孢子，包括3年攀枝花蘇鐵AMF孢子2種，8年生攀枝花蘇鐵AMF孢子2種及14年生攀枝花蘇鐵AMF孢子5種。

圖3 基于18Sr RNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 A phylogenetic tree developed by 18sr RNA gene

2.3 不同樹齡的攀枝花蘇鐵AMF多樣性及相關性分析

由表3可知，攀枝花蘇鐵AMF侵染率隨年齡增長呈現(xiàn)增加的趨勢，14年生攀枝花蘇鐵根際土壤AMF孢子密度為16.02個/g，8年生攀枝花蘇鐵根際土壤孢子密度為14.13個/g，3年生攀枝花蘇鐵根際土壤孢子密度為13.3個/g，結果表明AMF孢子密度也隨樹齡的增加呈現(xiàn)遞增的趨勢。

表3 不同樹齡攀枝花蘇鐵AMF定殖率與AMF孢子密度的相關性Table 3 The correlation betweenthe colonization rate and spore density of AMF in Cycas panzhihuaensis trees with different ages

通過菌根定殖率與孢子密度的相關性分析，得到二者之間的相關性是0.873 9，呈顯著的正相關關系。由此得出，隨著樹齡增加，菌根真菌定殖率、孢子密度、豐富度和多樣性指數(shù)均能夠增加。

3 結論與討論

在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，土壤微生物能夠影響植物生長、群落組成和種類多樣性，同時陸地植物也會影響土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)，兩者形成動態(tài)相互作用的關系[22]。當宿主植物發(fā)生改變時，土壤中的AM真菌種類和數(shù)量也會發(fā)生改變。本研究對干熱河谷攀枝花蘇鐵自然保護區(qū)的不同樹齡的攀枝花蘇鐵根際土壤AM真菌進行分離、物種鑒定以及菌根定殖進行分析后發(fā)現(xiàn)，土壤AMF定殖率、孢子密度、多樣性指數(shù)與樹齡密切相關，首次報道了AMF在宿主蘇鐵中的定殖率和多樣性，填補了空白。

本研究中，3年生、8年生和14年生的攀枝花蘇鐵AMF定殖率分別為21.10%、28.54%和36.13%，孢子密度分別為13.3、14.13個/g和16.02個/g，說明蘇鐵種植8 a就達到了較穩(wěn)定的菌根真菌定殖率，這與樹齡越大，抗逆性越強是一致的。大量研究結果表明，AMF定殖率及群落組成受到生態(tài)環(huán)境中的氣候和土壤條件影響很大[23]，同時也受到植株年齡的影響[24]。研究發(fā)現(xiàn)，不同生長年齡的攀枝花蘇根際土壤中AMF種類存在差異，14年生攀枝花蘇鐵孢子密度最高，且分離出的AMF種類也最多，鑒定出16個種的AMF；8年生的次之，共鑒定出14個種的AMF；而3年生攀枝花蘇鐵只有6個種的AMF。究其原因，一方面可能是因為AMF能夠促進宿主植物對土壤養(yǎng)分等的吸收，促進植物生長；另一方面宿主植物能夠為AMF提供碳水化合物，與之互惠共生的AMF屬的數(shù)目也相對增加[25]。這在一定程度上表明樹齡越長，越能夠為AMF提供更適宜的生存和繁殖條件，不同的樹齡，隨生物量增加，AMF多樣性豐富，定殖率增高，抵抗不良環(huán)境，改善環(huán)境條件，土壤AMF多樣性增加，增加P的吸收，增加固N作用，生物量增加。同時AMF對提高苗木和植物的總生物量、總根長、根表面積、根投影面積和根體積具有積極作用。樹木能長出更多的根，通過根直徑的函數(shù)改變根系增殖，以增加植物營養(yǎng)中選擇性覓食的能力[26]。通過與植物形成共生體，AMF可以改變植物根系形態(tài)，主要增加根系生物量，從而提高根系覓食和吸收養(yǎng)分的能力，進而改變植物的整體生長潛力。不同樹齡的攀枝花蘇鐵土壤中，球囊霉屬的AMF相對豐度較高，這可能是因為球囊霉屬具有較強的環(huán)境適應能力和獨特的繁殖特性[27]，較高的產孢率能夠使其在不同環(huán)境中定殖，因此分布廣泛。而3年生攀枝花蘇鐵中無梗囊霉屬相對豐度高于14年生攀枝花蘇鐵，無梗囊霉屬的AMF往往在酸性環(huán)境條件下的土壤中具有較高的產孢率[28]。

AM真菌的分離鑒定是保護以及利用微生物資源最基本也是最重要的工作。AM真菌幾乎可以存在于土壤中任何地方，且有豐富的物種多樣性。近年來，有關AM真菌物種多樣性研究越來越多，下一步試驗中希望通過探究土壤理化性質，從而了解土壤與AMF之間的相關性。通過完善植物AM真菌的種質資源調查，對篩選高效菌種以及農林業(yè)菌根真菌資源的開發(fā)和應用具有重要的意義。