龍膽瀉肝丸中木通的鑒別研究

周云峰，謝婷，鄧杰華，李存金，楊建冬，黃炳泉

1.宜春市檢驗(yàn)檢測中心，江西 宜春 336000；2.宜春市人民醫(yī)院，江西 宜春 336000；3.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330000

龍膽瀉肝丸（水丸）的原處方含有關(guān)木通，收載于《中國藥典》2000 年版一部［1］，由于龍膽瀉肝丸腎毒性事件［2］，2003 年國家藥品監(jiān)督管理局取消了關(guān)木通（含馬兜鈴酸）的藥用標(biāo)準(zhǔn)，并責(zé)令把龍膽瀉肝丸處方中的關(guān)木通更換為木通（木通科），現(xiàn)收錄于《中國藥典》2020 年版一部［3］。然而，現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)沒有對龍膽瀉肝丸方中木通的質(zhì)量進(jìn)行控制，難以知悉木通投料的真實(shí)情況，加上市場仍存在關(guān)木通、川木通等混淆作木通使用的情況［4-7］，這可能會對含有木通藥味的中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量帶來較大風(fēng)險?；诖耍瑸榱擞行ПＷC龍膽瀉肝丸安全、有效、質(zhì)量可控，本研究采用超高液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立龍膽瀉肝丸中木通的定性鑒別方法，為提升龍膽瀉肝丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、進(jìn)一步控制制劑的整體質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)參考和技術(shù)支撐。

1 儀器與試藥

超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國waters 公司，液相儀型號：H-class，質(zhì)譜儀型號：xevo TQD）；MS205DU 電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；TLE 204E 萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；PL-S60 超聲波清洗儀（東莞康士潔超聲波科技有限公司）。

龍膽瀉肝丸（共抽取市售產(chǎn)品36 批，均為水丸，涉及17 個生產(chǎn)廠家，36 個批號，4 個規(guī)格：每100粒重6 g、每袋裝6 g、60 g/瓶、每袋裝3 g）；木通對照藥材（批號：201101，來源于湖南省松齡堂中藥飲片有限公司，由本中心楊建冬主任中藥師鑒定）；川木通對照藥材（批號：121409-202003，中國食品藥品檢定研究院）；關(guān)木通對照藥材（批號：DST201219-072，成都德思特生物技術(shù)有限公司）；甘木通對照藥材（批號：121443-201102，中國食品藥品檢定研究院）；木通苯乙醇苷B 對照品（批號：111910-201604，純度98.2%，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（質(zhì)譜級，德國默克股份兩合公司）；甲酸（質(zhì)譜級，賽默飛世爾科技有限公司）；甲醇（色譜級，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；水（蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測條件

液相條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，流動相乙腈A 和0.1%甲酸溶液B（梯度洗脫程序：0～13 min，90%～25% B；13～15min，25% B；15.01～17 min，90% B），流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，柱溫30 ℃；質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI-），溫度150 ℃，子離子掃描模式，母離子m/z 477［M-H］-，掃描范圍60～600 m/z，質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)時間0～10 min，毛細(xì)管電壓0.5 kV，錐孔電壓-55 V，碰撞電壓30 V，錐孔氣流量50 L/h，脫溶劑氣流量900 L/h，脫溶劑氣溫度550 ℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液精密稱取木通苯乙醇苷B 對照品適量，加70%甲醇溶液溶解稀釋成約0.5 μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液樣品研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，加入70%甲醇溶液約80 mL，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）60 min，放冷，加70%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對照藥材溶液取木通、川木通、甘木通和關(guān)木通對照藥材各0.1 g，精密稱定，分別按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的處理方法制備對照藥材溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液方中各藥味均以原粉入藥，按照處方比例，制備缺木通藥味的龍膽瀉肝丸陰性樣品粉末，取約1 g，精密稱定，再按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的處理方法制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性

取陰性樣品溶液、對照藥材溶液、木通苯乙醇苷B 對照品溶液和供試品溶液各2 μL，按2.1項(xiàng)下檢測條件依次進(jìn)行測定，子離子掃描的總離子流圖（TIC）見圖1。結(jié)果表明，市售樣品溶液的一級質(zhì)譜出現(xiàn)與木通苯乙醇苷B 對照品溶液、木通對照藥材溶液保留時間一致的色譜峰，而陰性樣品溶液、川木通對照藥材溶液、關(guān)木通對照藥材溶液和甘木通對照藥材溶液均未檢出與木通苯乙醇苷B 對照品溶液保留時間一致的色譜峰，說明陰性樣品溶液對檢測無干擾，且川木通、關(guān)木通和甘木通不含有木通的特征性成分木通苯乙醇苷B，專屬性良好。

圖1 各溶液EIC提取離子流圖：A.陰性樣品；B.川木通；C.關(guān)木通；D.甘木通；E.木通；F.木通苯乙醇苷B對照品；G.供試品

2.4 樣品結(jié)果

取36 批水丸樣品，制成供試品溶液后，按“2.1”項(xiàng)下檢測條件測定。結(jié)果可知，所有樣品的一級質(zhì)譜均檢出與木通苯乙醇苷B 對照品溶液保留時間一致的色譜峰，且樣品的二級質(zhì)譜的主要碎片離子為315、281、179、161、135、119 和89，與木通苯乙醇苷B 對照品和木通對照藥材的主要碎片離子一致，說明所抽取的龍膽瀉肝丸樣品均含有木通苯乙醇苷B 成分。

3 討論

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有分析速度快、靈敏度高、選擇性好、專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，被廣泛用于藥品非法添加成分檢查及中藥復(fù)方制劑中藥味的定性和定量分析［8-13］。木通苯乙醇苷B 是木通的特征性定量成分［3,14-15］，本研究嘗試采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對其進(jìn)行快速鑒別分析，采用了子離子掃描檢測模式，同時采用正、負(fù)離子切換模式測試，發(fā)現(xiàn)采用負(fù)離子模式，木通苯乙醇苷B 具有較高的質(zhì)譜響應(yīng)。

方法的耐用性試驗(yàn)，主要對不同色譜柱、不同溫度和不同流速進(jìn)行了考察。色譜柱使用了Waters 公司的Waters ACQUITY UPLC BEH C18 柱和Waters ACQUITY UPLC CSH C18 柱；溫度設(shè)定了25 ℃、30 ℃和35 ℃三個溫度；流速測試了三種（0.2 mL/min、0.25 mL/min 和0.3 mL/min）。結(jié)果顯示不同色譜柱、不同溫度和不同流速對測定結(jié)果無影響，只會影響目標(biāo)化合物的出峰時間。

水丸樣品處方中各藥味均以原粉入藥，木通投料占比量約為7.1%，稱取1.0 g 左右的樣品約相當(dāng)于0.1 g 的木通原料。為了考察川木通、關(guān)木通和甘木通中是否含有木通的特征性化學(xué)成分木通苯乙醇苷B，川木通、關(guān)木通和甘木通對照藥材各稱取約0.1 g，以水丸樣品相同的處理方法制備對照藥材溶液進(jìn)行測定比較，結(jié)果顯示川木通、關(guān)木通和甘木通對照藥材均未檢出木通苯乙醇苷B，而市售樣品和木通對照藥材均可檢出，說明所建方法能夠?qū)悠分心就ㄟM(jìn)行準(zhǔn)確定性分析，可有效甄別是否有混淆品冒充替代木通進(jìn)行投料，可作為龍膽瀉肝丸中木通質(zhì)量的控制方法。