柏子養(yǎng)心片中非法著色劑808 猩紅的測(cè)定

彭玲娜，趙勇，孫輝，李文莉

湖南省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，湖南省藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)工程技術(shù)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410001

柏子養(yǎng)心片是由炙黃芪、川芎、朱砂等十三味藥材組成，具有補(bǔ)氣、養(yǎng)血安神的功效［1］。組方中朱砂為生粉入藥，近年來(lái)，朱砂染色摻假現(xiàn)象已被廣泛關(guān)注和報(bào)道，808 猩紅（808 scarlet）為常用的著色劑之一，其在機(jī)體內(nèi)經(jīng)生物轉(zhuǎn)化分解，可形成致癌物，具有強(qiáng)致癌和致突變性［2-5］。朱砂作為柏子養(yǎng)心片的生產(chǎn)原料，有可能將808 猩紅著色劑帶入制劑中，因此有必要對(duì)制劑進(jìn)行808 猩紅的檢測(cè)研究。本研究采用HPLC 和LC-MS 檢測(cè)方法［6-9］，對(duì)柏子養(yǎng)心片中808猩紅進(jìn)行檢測(cè)，其方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、重現(xiàn)性佳，為該品種安全性方面的質(zhì)量控制提供了可靠的檢驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters E2695 高效液相色譜儀（DAD 檢測(cè)器）；Waters Acquity UPLC，Xevo G2 Q-TOF 質(zhì)譜儀（美國(guó)，Waters 公司）；XS205 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；超聲波清洗（KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司）

1.2 試藥

水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑為分析純；808 猩紅對(duì)照品（來(lái)源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111940-201804）。柏子養(yǎng)心片（A 廠，批號(hào)：140605、140801、111101、130105、130410、111201、131007、120209、131005；B 廠，批 號(hào)：20140201、20140401、20130601）。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 條件

色譜柱：ECOSIL C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸（B）（85∶15）為流動(dòng)相；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為520 nm。

2.2 對(duì)照溶液的制備

精密稱取808 猩紅對(duì)照品7.20 mg，至100 mL量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，得808 猩紅對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.072 mg/mL）；精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，至10 mL 量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，得對(duì)照品溶液（7.2 μg/mL）。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品適量，除去包衣，取約10 g，精密稱定，精密加入丙酮20 mL，稱重后超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用丙酮補(bǔ)重，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 專屬性試驗(yàn)

2.4.1 808 猩紅的HPLC 法測(cè)定分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果供試品呈現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，而陰性樣品則無(wú)相應(yīng)的對(duì)照品色譜峰（圖1）。采用DAD 檢測(cè)器檢測(cè)400～600 nm 范圍內(nèi)的光譜圖，供試品色譜峰的吸收光譜與808 猩紅對(duì)照品紫外吸收光譜一致（圖2）。

圖1 高效液相色譜圖：A.陰性樣品；B.808猩紅對(duì)照品；C.供試品

圖2 紫外光譜圖：A.對(duì)照品；B.供試品

2.4.2 808 猩紅的LC-MS 方法確證流動(dòng)相：乙腈-0.02 mol/L 乙酸銨，梯度洗脫；流速0.2 mL/min；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量1 μL。離子源：ESI，正離子檢測(cè)；檢測(cè)模式：SIM；毛細(xì)管溫度400 ℃，鞘氣流速：600 L/h，電壓：源3.6 KV，錐孔電壓：25 V。采用ESI 正離子掃描模式，以m/z 368 為母離子，選擇質(zhì)荷比（m/z）368.3 →275.2 作為檢測(cè)離子對(duì)。供試品中可提取到808 猩紅一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖，與808 猩紅對(duì)照品質(zhì)譜圖結(jié)果一致。質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 色譜質(zhì)譜圖：A.808猩紅對(duì)照品一級(jí)質(zhì)譜圖；B.供試品一級(jí)質(zhì)譜圖；C.808猩紅對(duì)照品二級(jí)質(zhì)譜圖；D.供試品中808猩紅二級(jí)質(zhì)譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.072 mg/mL）1、3、5、7、10、20 μL，對(duì)照品溶液（7.2 μg/mL）1 μL 分別注入液相色譜儀，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積的值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為：Y=3 715 327.45X-47 103.20，r=0.999 9。結(jié)果表明：808 猩紅對(duì)照品在0.007 2～1.440 0 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 檢測(cè)限與定量限

按上述色譜條件將808 猩紅對(duì)照品溶液稀釋，進(jìn)行測(cè)定。以信噪比（S/N）約為3 和10 時(shí)的進(jìn)樣量（ng）為檢測(cè)限和定量限，結(jié)果當(dāng)S/N=3 時(shí)檢測(cè)限為2.8 ng；當(dāng)S/N=10 時(shí)定量限為5.76 ng。

2.7 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液按“2.1”項(xiàng)下的色譜方法，重復(fù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果峰面積積分值的RSD 為1.10%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)柏子養(yǎng)心片樣品（A 廠，批號(hào)：140605），平行制備6 份供試品溶液按“2.1”項(xiàng)下的色譜方法測(cè)定，結(jié)果808 猩紅含量的RSD 為1.91%（n=6）。表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一柏子養(yǎng)心片供試品溶液，在0、6、12、24 h 分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄808 猩紅的峰面積，結(jié)果RSD 為0.42%（n=6）。表明24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取柏子養(yǎng)心片樣品（A 廠，批號(hào)：140605）約5 g，精密加入濃度為0.072 mg/mL 的對(duì)照品溶液0.6 mL，按照供試品溶液的制備方法，制成6 份供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下的色譜方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均回收率為97.86%，RSD=1.24%（n=6）。

2.11 樣品測(cè)定

取不同廠家，不同批號(hào)柏子養(yǎng)心片樣品12 批，按照“2.3”項(xiàng)下的方法制備樣品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果12 批次樣品中有2批次檢出808 猩紅，見(jiàn)表1。

表1 柏子養(yǎng)心片樣品測(cè)定結(jié)果（n=3，μg/g）

3 討論

3.1 樣品提取條件考察

分別比較了70%乙醇、乙醇、70%甲醇、甲醇、丙酮五種試劑作為超聲提取溶劑，結(jié)果以丙酮提取的含量最高。在此基礎(chǔ)上，比較了加熱回流、超聲處理兩種方法對(duì)提取的影響，結(jié)果兩種方式提取的含量相當(dāng)，故采用操作簡(jiǎn)便的超聲提取方式。同時(shí)考察了20、30、60 min 三種提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，結(jié)果表明30 min 已提取完全，因此最終選擇丙酮超聲提取30 min 作為樣品制備方法。

3.2 HPLC 色譜條件考察

分別考察了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.02 mol/L 乙酸銨溶液不同比例的流動(dòng)相，考察了30 ℃、35 ℃、40 ℃的柱溫以及0.8 mL/min、1.0 mL/min 流速，最終確定以乙腈-0.1%甲酸溶液（85∶15）為流動(dòng)相；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min的分離效果最佳，色譜峰純度較高，該HPLC 法可用于柏子養(yǎng)心片中808 猩紅的含量測(cè)定。

3.3 液質(zhì)聯(lián)用方法

采用LC-MS 液質(zhì)聯(lián)用法，對(duì)HPLC 法檢出808 猩紅的陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證。采用ESI 正離子模式，以m/z 368 為母離子，選擇質(zhì)荷比（m/z）368.3 →275.2 作為檢測(cè)離子對(duì)，可有效鑒別柏子養(yǎng)心片中非法著色劑808 猩紅。

柏子養(yǎng)心片中藥味較多，肉桂、黨參、半夏曲和朱砂為原粉入藥，引入的808 猩紅可能來(lái)源于朱砂藥材。根據(jù)樣品檢測(cè)結(jié)果，12 批次樣品中有2 批次檢出808 猩紅，提示柏子養(yǎng)心片中的投料藥材仍然存在非法染色現(xiàn)象，非法染色危害向制劑中轉(zhuǎn)移現(xiàn)象不容忽視。監(jiān)管部門應(yīng)高度關(guān)注中藥材及飲片質(zhì)量，加強(qiáng)對(duì)藥材質(zhì)量的控制，有效防止藥材中非法添加色素帶入制劑中，確保人民群眾用藥安全。