構(gòu)建“免疫相關(guān)lncRNA基因?qū)Α蹦Ｐ皖A(yù)測未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原位肝癌預(yù)后及藥物敏感性

李睿哲，薛軍帥，楊龍山，董兆如，洪建國，李濤，王東旭

（山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 肝膽外科，山東 濟(jì)南 250012）

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）排在最常見惡性腫瘤的第六位，腫瘤致死病因的第三位。盡管由于疫苗以及抗病毒藥物的有效應(yīng)用，東南亞國家的肝癌發(fā)病呈現(xiàn)下降趨勢，但在歐洲、北美地區(qū)則呈現(xiàn)上升趨勢，因此全球肝癌的發(fā)病形勢依然嚴(yán)峻，尋求對肝癌的全方位防治尤為重要[1]。手術(shù)切除是肝癌獲得根治的主要手段，然而初始可手術(shù)切除的腫瘤僅占到了15%～30%，多數(shù)患者在診斷后已處于中晚期，無法行一期根治性切除[2]。因此，系統(tǒng)治療在肝癌的整體治療中舉足輕重。隨著近幾年來靶向、免疫治療的進(jìn)展，肝癌的系統(tǒng)治療藥物逐漸增多[3]。而基于這些藥物的療效，患者生存期不斷延長的同時，晚期肝癌降期轉(zhuǎn)化切除比例逐漸增多[4]。然而，能夠在系統(tǒng)性藥物的幫助下轉(zhuǎn)化降期，進(jìn)而獲得根治性手術(shù)的肝癌主要局限在肝內(nèi)，有明確的肝外擴散患者則希望渺然。同時，當(dāng)前研究表明，肝癌轉(zhuǎn)移離開肝臟后定植于機體其他器官組織，受限于不同的生長環(huán)境，腫瘤內(nèi)的微環(huán)境與原位相比差異明顯，藥物治療的敏感性也有所不同[5-6]。因此，針對未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝癌，特異篩選出該類樣本，探索其內(nèi)微環(huán)境特點并發(fā)現(xiàn)能夠與其性質(zhì)相關(guān)的特異生物標(biāo)志物有利于進(jìn)一步提高治療效果。

長鏈非編碼RNA（lncRNAs）是一種長度超過200 bp的非編碼RNA并廣泛參與了機體細(xì)胞增殖、分化、調(diào)控等諸多生理過程[7-9]。當(dāng)前研究表明lncRNAs與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)并且特定的lncRNAs對相關(guān)疾病的疾病特征有一定的預(yù)測價值，如腫瘤、心血管疾病、內(nèi)分泌疾病等[8-9]。此外，lncRNAs可以作為在包括肝癌在內(nèi)的多癌癥中的良好預(yù)后生物標(biāo)志物[10]。

1 資料和方法

1.1 研究數(shù)據(jù)納入及整理

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)準(zhǔn)備：從XENA數(shù)據(jù)庫（https://xenabrowser.net/datapages/）下載了TCGA-LIHC隊列369例患者共421份樣本的表達(dá)量數(shù)據(jù)，其中371份為肝細(xì)胞肝癌組織樣本，50 份為正常組織樣本，同時下載了GTEx數(shù)據(jù)庫中的110 份正常肝組織樣本。數(shù)據(jù)類型為TPM數(shù)據(jù)。LncRNA名稱數(shù)據(jù)的提取和原始矩陣的所有RNA的名稱匹配全部對照的是第23版本的GTF基因注釋文件。臨床數(shù)據(jù)準(zhǔn)備：下載TCGA-LIHC隊列和GETx數(shù)據(jù)庫中肝臟的臨床數(shù)據(jù)，去除有明確的轉(zhuǎn)移M1或者轉(zhuǎn)移狀態(tài)不明確Mx的患者的表達(dá)量數(shù)據(jù)，保留未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的M0患者的表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 免疫lncRNA“共表達(dá)基因?qū)Α钡臉?gòu)建

提取免疫相關(guān)lncRNA：免疫基因集獲取于ImmPort數(shù)據(jù)庫（http://www.immport.org）；通過免疫基因與lncRNA共表達(dá)分析鑒定出免疫相關(guān)性lncRNA；通過“l(fā)imma”數(shù)據(jù)包提取正常組織和腫瘤組織中差異表達(dá)的lncRNA，過濾條件設(shè)定為FDR＜0.05以及|logFC|＞1。對獲取的所有的lncRNA進(jìn)行兩者之間的表達(dá)情況比較，表達(dá)上升的基因?qū)?biāo)記為“1”，反之為“0”。

1.3 “免疫lncRNA基因?qū)Α鳖A(yù)后模型建立

獲得的免疫lncRNA基因?qū)εc患者的生存數(shù)據(jù)整合。單因素Cox回歸篩選出具有預(yù)后相關(guān)的候選基因?qū)?，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。對單因素Cox回歸篩選出的免疫LncRNA基因?qū)\用LASSO回歸模型進(jìn)行進(jìn)一步壓縮篩選，并進(jìn)行交叉驗證。多因素Cox回歸模型分析鑒定出的免疫lncRNA基因與患者的總生存OS關(guān)系。患者風(fēng)險值計算公式為：

Riskscore=h0(t)×expCoefficient(Genei)×Exp(Genei)。h0(t)為基準(zhǔn)風(fēng)險函數(shù)，Coefficient(Genei)為多因素Cox回歸分析得到的第i個基因的回歸系數(shù)，Exp(Genei)為第i個基因的表達(dá)量。

1.4 預(yù)后風(fēng)險模型（IRLP）與患者生存及臨床因素的相關(guān)性

利用ROC受試者曲線繪制患者風(fēng)險值對生存的預(yù)測圖形，確定最優(yōu)Cutoff值，根據(jù)Cutoff值區(qū)分患者為高風(fēng)險組（H組）以及低分險組（L組）。同時，根據(jù)患者生存時間分為1、2、3 年生存率，分別計算AUC。根據(jù)患者風(fēng)險分組情況對患者生存情況進(jìn)行比較，并進(jìn)行Log-rank檢驗。結(jié)合臨床因素及患者風(fēng)險值進(jìn)行獨立預(yù)后分析驗證。

1.5 免疫浸潤分析

免疫浸潤分析數(shù)據(jù)庫TIMER（http://timer.cistrome.org）下載腫瘤免疫細(xì)胞浸潤數(shù)據(jù)。根據(jù)免疫相關(guān)基因的表達(dá)，利用多軟件計算樣本中的免疫細(xì)胞浸潤豐度。利用Wilcoxon檢驗計算不同風(fēng)險組免疫細(xì)胞的差異，P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析鑒定樣本風(fēng)險值與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性。計算在高低風(fēng)險組間免疫檢查點相關(guān)基因的表達(dá)差異。

1.6 藥物敏感性分析

pRRophetic算法根據(jù)GDSC細(xì)胞系表達(dá)譜和TCGA基因表達(dá)譜構(gòu)建嶺回歸模型預(yù)測藥物IC50。選取了在肝癌做過三期臨床試驗的相關(guān)藥物索拉非尼（Sorafenib）、順鉑（Cisplatin）、阿昔替尼（Axitinib）、舒尼替尼（Sunitinib）、埃羅替尼（Erlotinib）、拉帕替尼（Lapatinib）并利用“pRRopheticPredict”工具包評估肝癌治療中多種藥物在不同風(fēng)險組的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 研究納入樣本及篩選流程

本研究的數(shù)據(jù)篩選流程在圖1A 中展示。從XENA數(shù)據(jù)庫（https://xenabrowser.net/datapages/）下載了TCGA-LIHC隊列的421 份樣本的表達(dá)量數(shù)據(jù)，其中371 份為肝細(xì)胞肝癌組織樣本，50 份為正常組織樣本，同時下載了GTEx數(shù)據(jù)庫中的110份正常肝組織樣本。數(shù)據(jù)類型為TPM數(shù)據(jù)。lncRNA名稱數(shù)據(jù)的提取和原始矩陣的所有RNA的名稱匹配全部對照的是第23版本的GTF基因注釋文件。去除平均表達(dá)量小于0.5 的基因，肝癌樣本中去除有明確的轉(zhuǎn)移M1或者轉(zhuǎn)移狀態(tài)不明確Mx的患者的肝癌樣本共106份，保留未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的M0患者的肝癌樣本265份進(jìn)行后續(xù)分析。

圖1 流程圖、差異分析火山圖與熱圖

2.2 “免疫lncRNA基因?qū)Α蹦Ｐ停↖RLP）構(gòu)建

基于從免疫基因數(shù)據(jù)庫ImmPort database（http://www.immport.org）下載的免疫基因，使用R軟件從LIHC隊列的表達(dá)矩陣中提取出1030 個免疫基因的表達(dá)矩陣。根據(jù)23版GTF基因注釋文件從肝癌表達(dá)矩陣中提取出lncRNA的表達(dá)矩陣，我們使用共表達(dá)分析的方法找出與免疫基因表達(dá)相關(guān)的lncRNA為841個（相關(guān)系數(shù)＞0.5），之后我們通過使用“l(fā)imma”工具包找出在肝癌標(biāo)本與正常肝組織中表達(dá)差異的免疫相關(guān)lncRNA 261個（圖1B），肝癌組織與正常肝組織中上調(diào)、下調(diào)的差異表達(dá)的免疫相關(guān)lncRNA的熱圖見圖1C。通過迭代循環(huán)和0或1個矩陣篩選，獲得了17 835 對差異表達(dá)的lncRNA基因?qū)?。去除生存?shù)據(jù)不完整的患者和生存時間為0 d的患者，剩余261 例肝癌患者進(jìn)行后續(xù)的生存分析。通過單因素Cox回歸分析根據(jù)篩選條件P＜0.05的到2 456個差異表達(dá)的lncRNA基因?qū)?，表明? 456個差異表達(dá)的lncRNA基因?qū)εc肝癌患者的預(yù)后相關(guān)，之后將其進(jìn)行LASSO回歸分析和使用交叉驗證的方法進(jìn)行迭代分析，并將其的篩選得到的lncRNA基因?qū)M(jìn)行逐步回歸多因素Cox回歸分析得到9 個預(yù)后相關(guān)的lncRNA基因?qū)ΓˋC009014.3|RP11-800A18.4、CTB-193M12.5|KB-68A7.1、CTC-518P12.6|RP5-1171I10.5、F11-AS1|RP5-940J5.9、KB-68A7.1|RP11-196G18.23、MIR503HG|RP11-498C9.15、MKLN1-AS|RP11-325K4.2、RP11-196G18.23|RP5-1171I10.5、RP11-498C9.15|RP13-104F24.2）（圖2A），并根據(jù)其多因素Cox回歸分析的相關(guān)系數(shù)來計算每個肝癌患者的風(fēng)險打分，并建立免疫lncRNA基因?qū)δＰ停↖RLP），其模型公式為：

圖2 免疫相關(guān)lncRNA基因?qū)︻A(yù)后模型質(zhì)量評估

2.3 “免疫lncRNA基因?qū)Α迸c患者的預(yù)后相關(guān)性分析

分析免疫lncRNA基因?qū)δＰ停↖RLP）的時間依賴性受試者工作特征曲線（ROC曲線），得到1、2、3年的曲線下面積（AUC值）分別為0.859、0.885、0.900（圖2B），并且以1 年ROC曲線最大喬丹指數(shù)處的截止點的對應(yīng)值作為截止值為3.529（圖2C）。本模型1、2、3年的AUC值均大于0.850，表明IRLP預(yù)后模型中的9 個deirlncRNA基因?qū)τ谠桓伟┗颊呱骖A(yù)測具有高度的敏感性和特異性。之后，我們根據(jù)選取的截止值3.529和每份肝癌患者對應(yīng)的風(fēng)險打分將患者分為高風(fēng)險組（n=111）和低風(fēng)險組（n=150）并畫出K-M曲線，結(jié)果表明高低風(fēng)險組的預(yù)后差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖2D）也表明了該9個差異表達(dá)的lncRNA基因?qū)τ蓄A(yù)測肝癌患者預(yù)后的有效性?；颊叩娘L(fēng)險曲線和生存時間隨風(fēng)險的分的分布見圖3A、3B。風(fēng)險曲線顯示，高風(fēng)險組HCC患者的病死率高于低風(fēng)險組。排除無年齡、性別、分級和腫瘤分期信息的患者，對訓(xùn)練組的樣本進(jìn)行多因素Cox回歸分析，以評估獨立的危險因素。森林圖顯示，臨床分期（HR1.500，95%CI1.131～1.988，P=0.005）和IRLP風(fēng)險打分（HR1.074，95%CI1.055～1.094，P＜0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3B）。在多因素回歸分析中，IRLP風(fēng)險打分（HR1.074，95%CI1.055～1.094，P＜0.001）（圖3B、3C）是影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素。臨床相關(guān)熱圖顯示，風(fēng)險打分與腫瘤分級、臨床分期和T分期相關(guān)（圖3D）。

2.4 免疫浸潤分析

由于lncRNA與免疫相關(guān)基因相互關(guān)聯(lián)，我們進(jìn)一步探討了該模型與腫瘤免疫微環(huán)境之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，模型中的高風(fēng)險組與多種免疫細(xì)胞有相關(guān)性，見圖4A。XCell基于標(biāo)記基因，計算64 種免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞相對富集分?jǐn)?shù)，通過比較并制作箱式圖，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞分?jǐn)?shù)與免疫微環(huán)境分?jǐn)?shù)在低風(fēng)險組中顯著高于高風(fēng)險組（圖4B、4C）。CD8+T細(xì)胞在腫瘤免疫微環(huán)境中期重要作用，通過比較并制作箱式圖發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞在低風(fēng)險組中顯著高于高風(fēng)險組（圖4D）。以上表明低風(fēng)險組的肝癌患者擁有較高的免疫浸潤。之后，我們又分析了免疫調(diào)節(jié)基因包括免疫檢查點在內(nèi)的表達(dá)量在高低風(fēng)險組的差異情況。結(jié)果表明，高風(fēng)險組的免疫負(fù)性調(diào)節(jié)基因IL10RB、TGFBR1的表達(dá)量顯著高于低風(fēng)險組（P＜0.05）（圖5A、5B），潛在表明高風(fēng)險組的患者有較強的免疫抑制的腫瘤微環(huán)境。

圖4 免疫浸潤分析

2.5 藥物敏感性分析

藥物敏感性分析顯示，高風(fēng)險組中厄羅替尼（P=0.0081）、阿昔替尼（P=0.0056）的IC50高于低風(fēng)險組（圖5C、5D），低風(fēng)險組中的拉帕替尼（P=0.02）和臨床肝癌一線用藥索拉非尼（P=0.025）的IC50高于高風(fēng)險組（圖5E、5F）。結(jié)果表明，該模型可作為HCC治療藥物敏感性的潛在預(yù)測因子。

圖5 免疫調(diào)節(jié)基因與藥物敏感性分析

3 討論

本研究中，我們在未發(fā)生轉(zhuǎn)移的原位肝癌樣本中篩選出免疫相關(guān)lncRNA基因?qū)Γ⒔Y(jié)合患者的生存狀況建立了預(yù)測模型，該模型能夠獨立預(yù)測患者的生存狀況，低風(fēng)險組患者的生存獲益顯著優(yōu)于高風(fēng)險組（P＜0.001）。同時，在腫瘤免疫微環(huán)境方面，高風(fēng)險組表現(xiàn)出了更為突出的免疫抑制狀態(tài)。而基于表達(dá)數(shù)據(jù)的藥物敏感性分析表明了拉帕替尼、厄羅替尼、阿昔替尼以及順鉑在基于風(fēng)險分組的患者中敏感性的差異，潛在為更加精準(zhǔn)的應(yīng)用相關(guān)藥物提供了依據(jù)。

腫瘤數(shù)據(jù)庫保存的樣本涉及各個分期的腫瘤，當(dāng)前大部分研究采用TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時并沒有對各個分期的腫瘤進(jìn)行細(xì)致分類，這樣導(dǎo)致樣本中混雜了轉(zhuǎn)移瘤，復(fù)發(fā)腫瘤以及原位腫瘤等多種情況。而針對性的區(qū)分腫瘤，能夠避免腫瘤異質(zhì)性的混雜，排除干擾，更加精確地篩選出靶標(biāo)，從而建立預(yù)測價值更可靠的模型。

迄今為止，關(guān)于腫瘤中l(wèi)ncRNA的研究大部分集中在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的調(diào)控[11]。最近的研究表明，lncRNAs在腫瘤免疫的不同階段發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，包括抗原釋放、呈遞、免疫激活、免疫細(xì)胞遷移、腫瘤細(xì)胞的浸潤等[11-12]。lncRNA在腫瘤免疫中的研究能夠從一個新的角度揭示了腫瘤免疫中復(fù)雜的分子機制，潛在為腫瘤免疫治療提供新的潛在靶點。該研究中，我們建立的模型能夠很好的區(qū)分患者1、2和3年的生存獲益狀況；同時，該風(fēng)險分值在包括腫瘤病理分級，臨床分期的多因素下能夠獨立的預(yù)測患者預(yù)后。這表明該模型具有良好且穩(wěn)定的預(yù)測能力。盡管研究納入的數(shù)據(jù)是基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，然而，本研究采用基因?qū)Φ慕M合模式，對數(shù)據(jù)內(nèi)部之間進(jìn)行比較，而不需要進(jìn)行數(shù)據(jù)之間的校正，這樣以來避免了不同樣本間的數(shù)據(jù)偏差，有效降低了結(jié)果的偏倚[13]。

HCC中的腫瘤異質(zhì)性明顯。據(jù)估計，30%～50%的復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤具有與原發(fā)腫瘤不同的克隆，22%～79%的同位置腫瘤具有克隆性差異，12%～66%的單個腫瘤具有腫瘤內(nèi)異質(zhì)性[6，14]。大量的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性使得生物標(biāo)志物研究意義非凡，而這對于分子靶向治療的開發(fā)和管理也至關(guān)重要。同時，肝癌早期免疫浸潤豐富，腫瘤負(fù)荷較??；機體免疫并未完全失去戰(zhàn)斗力，此時腫瘤內(nèi)微環(huán)境特點與晚期腫瘤具有明顯區(qū)別。因此充分了解此類腫瘤的免疫微環(huán)境的特征更有利于免疫治療的開展，對早期應(yīng)用免疫治療更能提供相對精確的指導(dǎo)[15]。該研究基于XCELL計算了64 種免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞相對富集分?jǐn)?shù)，表明低風(fēng)險組的肝癌患者擁有較高的免疫浸潤，以及其免疫抑制情況較輕。在兩組免疫調(diào)節(jié)基因的表達(dá)量差異情況上，高風(fēng)險組的免疫負(fù)性調(diào)節(jié)基因IL10RB、TGFBR1的表達(dá)量顯著高于低風(fēng)險組，表明高風(fēng)險組腫瘤逐漸進(jìn)展衍生出更為廣泛的免疫逃逸。

肝癌系統(tǒng)治療近幾年取得長足進(jìn)步，包括索拉非尼、倫伐替尼等小分子靶向藥物、納武單抗等單克隆抗體在內(nèi)的藥物療效令人欣喜[16-17]。除了上述藥物被應(yīng)用到肝癌一線、二線治療外，還有一些潛在的藥物也正在臨床試驗或臨床前開發(fā)中[18]。拉帕替尼、厄羅替尼、阿昔替尼及順鉑均在肝癌開展過前瞻性的臨床試驗研究[19-21]，雖然并沒有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果，但其在特定類型或是狀態(tài)下肝癌的療效仍然值得關(guān)注。該研究中，對于不同風(fēng)險組其藥物敏感性具有顯著不同，這潛在提示基于該模型下肝癌患者分組后或許可以更加精準(zhǔn)的運用相關(guān)藥物。

盡管本研究進(jìn)行了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計，依然面對著一些問題。本研究中數(shù)據(jù)獲取于TCGA數(shù)據(jù)庫，其中肝癌TNM分期參考AJCC的指導(dǎo)原則，ⅣA期為沒有肝外腫瘤的轉(zhuǎn)移，僅有明確的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，ⅣB期患者為明確的肝外轉(zhuǎn)移患者。因此本研究中ⅣA期患者數(shù)量較少，其臨床相關(guān)性分析結(jié)果并不能完全說明問題。同時，對當(dāng)前肝癌細(xì)胞系藥物敏感性的模擬難以完全匹配機體肝癌的疾病特點[15，22]。不僅是在肝癌，在泛腫瘤中也是如此，腫瘤具有復(fù)雜的微環(huán)境特點，單獨的腫瘤細(xì)胞離體模擬只能提供潛在參考價值。

總之，本研究利用未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原位肝癌樣本構(gòu)建了免疫相關(guān)lncRNA的基因?qū)δＰ湍軌蜉^好的預(yù)測患者生存狀況，同時表明高風(fēng)險的患者中免疫抑制狀態(tài)明顯，而不同的風(fēng)險組對肝癌特定藥物治療敏感性不同。