黃芪湯對肝硬化門靜脈高壓癥大鼠門靜脈壓力的影響及作用機(jī)制研究

王浩藝，黃廣建，劉從進(jìn)，陳高峰，陳天陽，成揚(yáng)，3

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所，上海 201203；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海 200040；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海 201203

肝硬化門靜脈高壓癥（cirrhotic portal hypertension，CPH）是指在肝硬化基礎(chǔ)上，門靜脈系統(tǒng)血流受阻或血流量增加，導(dǎo)致門靜脈及其屬支壓力升高，并由此引起的一系列臨床綜合征，其中上消化道出血是CPH最主要的并發(fā)癥。目前西藥治療存在諸多禁忌癥及耐藥性等問題，外科治療也存在風(fēng)險，無法解決引起CPH的根本原因——肝纖維化，相反可能因肝臟血流量減少不利于肝損傷的修復(fù)。相關(guān)Meta分析顯示，中醫(yī)藥在治療肝硬化患者門靜脈高壓癥、改善血流動力學(xué)方面優(yōu)于普萘洛爾，針對CPH當(dāng)前治療存在的困境，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥寶庫中挖掘防治措施十分必要。

基于肝硬化“虛損生積”理論，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪湯可有效改善乙肝后肝硬化患者肝功能，減少門靜脈內(nèi)徑，改善食管胃底靜脈曲張程度，減小血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）含量。但其具體作用機(jī)制尚未明確。為此，本研究采用膽管結(jié)扎術(shù)制備CPH大鼠模型，基于VEGF及其下游信號通路觀察黃芪湯對模型大鼠門靜脈壓力的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量（180±10）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCX（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心清潔級動物房，溫度（20±2）℃、相對濕度50%～60%環(huán)境，12 h光照周期，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（PZSHUTCM2019041835）。

1.2 藥物及制備

黃芪湯（炙黃芪30 g，炙甘草5 g）顆粒，江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司提供（批號1212353），1.2 g黃芪湯顆粒相當(dāng)于黃芪原藥材6 g、炙甘草原藥材1 g。實驗時用蒸餾水配制成濃度為35、70、140 mg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

大鼠VEGF ELISA檢測試劑盒，上海晶抗生物公司，貨號JLC2293；DAB顯色試劑盒，南京建成生物工程研究所，貨號W026-1-2；血管性血友病因子（vWF）抗體、CD31 抗體、VEGF 抗體，美國Proteintech 公司，貨號分別為27186-1-AP、66065-2-Ig、66828-1-Ig；GAPDH 抗體、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抗體、p-PI3K抗體、蛋白激酶B（Akt）抗體、p-Akt抗體、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體，美國Cell Signaling Technology公司，貨號分別為5174、4249、4228、4685、4060、32027。Power Lab生理數(shù)據(jù)處理和分析系統(tǒng)，澳大利亞ADI公司；SCN400型數(shù)字化病理切片掃描儀，德國Leica公司；Excelsior ES全自動組織脫水機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific 公司；HD-330型烤片機(jī)，天津市惠達(dá)實驗儀器有限公司；DENLEY DRAGON Wellscan MK3酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；Wellwash 4 MK2洗板機(jī)，美國Thermo公司；Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)，美國Li-Cor公司。

2 實驗方法

2.1 造模

將50只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（10只）和造模組（40只）。參考文獻(xiàn)[8]采用膽管結(jié)扎術(shù)制備CPH大鼠模型：稱量大鼠體質(zhì)量，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（2 mL/kg），仰臥位固定于實驗臺，皮膚消毒，于劍突下沿腹正中行一約3 cm切口，暴露肝臟，分離膽總管，手術(shù)縫線雙重結(jié)扎后離斷，連續(xù)縫合肌層關(guān)腹。假手術(shù)組開腹后僅牽引膽總管但不做離斷結(jié)扎。

2.2 分組及給藥

大鼠行結(jié)扎術(shù)后禁食12 h，禁水4 h。1周后將造模大鼠隨機(jī)分為模型組和黃芪湯低、中、高劑量組，黃芪湯低、中、高劑量組分別予黃芪湯0.35、0.70、1.40 g/kg灌胃（相當(dāng)于60 kg成人臨床用量的3.5、7、14倍），灌胃體積1 mL/100 g，假手術(shù)組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，每周灌胃6 d，連續(xù)4周。

2.3 門靜脈壓力測定

給藥結(jié)束后，3%戊巴比妥鈉腹腔注射（2 mL/kg）麻醉大鼠，將大鼠固定于37 ℃保溫玻璃板上，沿腹壁正中剪一2 cm切口，打開腹腔，暴露門靜脈主干，分離腸系膜上靜脈，將遠(yuǎn)離門靜脈的一端結(jié)扎后剪一“V”形切口，插入PE-10管至門靜脈，接通壓力換能器，檢測門靜脈壓力。

2.4 取材

門靜脈壓力測定完畢后，下腔靜脈取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，分離血清，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。摘取肝臟，切取肝右葉同一位置組織（約1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm），置于10%福爾馬林溶液中固定，用于組織病理學(xué)檢測。稱取100 mg 肝組織，置于-80 ℃保存，用于Western blot檢測。

2.5 ELISA檢測

采用ELISA檢測血清VEGF含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

2.6 天狼猩紅染色

大鼠肝組織經(jīng)10%福爾馬林溶液固定后，經(jīng)組織脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，切片（厚約5 μm），天狼猩紅染色觀察肝組織纖維化程度，以數(shù)字化病理切片掃描儀進(jìn)行掃描分析，采用Image Scope軟件計算膠原染色面積。

2.7 免疫組化染色

石蠟切片65 ℃烤片60 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；置于枸櫞酸緩沖液中，微波爐100 ℃、8 min，60 ℃、25 min進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，PBS洗3次，3%HO滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加vWF一抗（1∶200）、CD31一抗（1∶600），4 ℃孵育過夜；次日37 ℃水浴箱復(fù)溫45 min，滴加相應(yīng)二抗（1∶10 000），37 ℃孵育20 min；DAB避光顯色3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，以黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，采用Image J軟件計算陽性表達(dá)的平均光密度。

2.8 Western blot檢測

取100 mg肝組織加入1 mL裂解液，高速分散機(jī)進(jìn)行勻漿，冰上靜置30 min，4 ℃、12 000×離心15 min，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，吸取30 μg蛋白置于10%SDS聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離后，半干法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，Odyssey緩沖液封閉1 h，加入VEGF一抗（1∶1 000）、p-PI3K一抗（1∶1 000）、PI3K 一抗（1∶1 000）、p-Akt一抗（1∶2 000）、Akt一抗（1∶1 000）、eNOS一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入相應(yīng)二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)掃描并分析，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 黃芪湯對模型大鼠門靜脈壓力的影響

實驗期間，模型組大鼠死亡2只、黃芪湯低劑量組死亡1只，其余各組大鼠無死亡。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠門靜脈壓力顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，黃芪湯中、高劑量組大鼠門靜脈壓力顯著降低（＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠門靜脈壓力比較（，mm Hg）

4.2 黃芪湯對模型大鼠血清血管內(nèi)皮生長因子含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清VEGF含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，黃芪湯各劑量組大鼠血清VEGF含量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），以黃芪湯高劑量組下降最顯著（＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清VEGF含量比較（，pg/mL）

4.3 黃芪湯對模型大鼠肝組織病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組大鼠肝組織僅匯管區(qū)和中央靜脈周圍有極少量陽性染色；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織膠原染色面積顯著增加（＜0.01），以匯管區(qū)為中心向肝實質(zhì)放射狀延伸，有假小葉形成；與模型組比較，黃芪湯各劑量組大鼠肝組織膠原染色面積顯著減少（＜0.05），纖維間隔變窄變細(xì)，以黃芪湯高劑量組效果最為明顯（＜0.05）。見表3、圖1。

圖1 各組大鼠肝組織形態(tài)（天狼猩紅染色，×100）

表3 各組大鼠肝組織膠原染色面積比較（，%）

4.4 黃芪湯對模型大鼠肝組織血管性血友病因子、CD31表達(dá)的影響

vWF和CD31是肝硬化肝竇毛細(xì)血管化的重要分子指標(biāo)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織vWF、CD31表達(dá)顯著升高（＜0.05），主要表達(dá)在增生膽管周圍，小葉中央靜脈周圍、匯管區(qū)；與模型組比較，黃芪湯各劑量組大鼠肝組織vWF、CD31陽性表達(dá)顯著降低（＜0.05），其中以黃芪湯高劑量組效果最明顯（＜0.05）。見圖2、圖3、表4。

表4 各組大鼠肝組織vWF、CD31陽性表達(dá)比較（）

圖2 各組大鼠肝組織vWF陽性表達(dá)（免疫組化染色，×100）

圖3 各組大鼠肝組織CD31陽性表達(dá)（免疫組化染色，×100）

4.5 黃芪湯對模型大鼠肝組織VEGF/PI3K/Akt/eNOS信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織VEGF、eNOS蛋白表達(dá)顯著升高，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，黃芪湯各劑量組大鼠肝組織VEGF、eNOS蛋白表達(dá)顯著降低，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值顯著降低，且黃芪湯高劑量組效果最明顯（＜0.05）。見圖4、表5。

圖4 各組大鼠肝組織VEGF、PI3K、Akt、eNOS蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠肝組織VEGF、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、eNOS蛋白表達(dá)比較（）

5 討論

結(jié)合癥狀體征，CPH可屬中醫(yī)學(xué)“積病”“臌脹”等范疇，張景岳強(qiáng)調(diào)“虛弱失調(diào)之人，多有積病”（《景岳全書·積聚》），李中梓指出“積之成者，正氣之不足也，而后邪氣居之”（《醫(yī)宗必讀》）。黃元御認(rèn)為，臌脹之根源在于“中氣敗壞，水不化氣而泛濫于上”。黃芪湯出自北宋《太平惠民和劑局方》，為黃芪與甘草6∶1相須配伍，擅補(bǔ)諸虛不足。基于此，本研究探索益氣補(bǔ)虛的黃芪湯對膽管結(jié)扎致CPH大鼠門靜脈壓力的影響及其作用機(jī)制。

在肝硬化尤其CPH患者中，血清VEGF水平明顯高于正常人，且與肝功能不全嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，因此下調(diào)血清VEGF水平對降低CPH患者門靜脈壓力有重要意義。本實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠門靜脈壓力顯著升高，血清VEGF水平顯著升高，經(jīng)黃芪湯干預(yù)后，大鼠門靜脈壓力、血清VEGF水平顯著降低，且以黃芪湯高劑量組更明顯。天狼猩紅染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織膠原沉積明顯，假小葉大量形成，黃芪湯干預(yù)后，大鼠肝組織膠原沉積明顯減少，其中黃芪湯高劑量組效果最為明顯，提示黃芪湯能改善大鼠肝纖維化程度，降低門靜脈壓力，與降低血清VEGF水平密切相關(guān)。

肝竇毛細(xì)血管化是肝竇內(nèi)皮細(xì)胞血管重構(gòu)的一種表現(xiàn)，與門靜脈高壓的形成密切相關(guān)。VEGF是肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表型調(diào)節(jié)器，參與肝竇毛細(xì)血管化過程。在肝纖維化及門靜脈高壓的形成過程中，常伴有血管過度增生和VEGF水平升高，導(dǎo)致門靜脈系統(tǒng)血流量增加，加速門體側(cè)支循環(huán)形成，惡化高動力循環(huán)狀態(tài)，最終使肝纖維化、門靜脈高壓與血管重構(gòu)、過度增生之間呈現(xiàn)惡性循環(huán)。vWF和CD31是反映肝竇毛細(xì)血管化、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表型變化的重要指標(biāo)。本實驗免疫組化結(jié)果顯示，與模型組比較，黃芪湯各劑量組大鼠肝組織vWF和CD31表達(dá)明顯降低，結(jié)合黃芪湯對門靜脈壓力的影響及肝竇毛細(xì)血管化與門靜脈高壓的相關(guān)性，說明黃芪湯降低門靜脈壓力與改善肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管化密切相關(guān)。

VEGF作為目前發(fā)現(xiàn)的特異性高、作用強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，能促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，增強(qiáng)血管通透性，從而促進(jìn)血管重構(gòu)與新生。VEGF介導(dǎo)的PI3K/Akt/eNOS信號傳導(dǎo)通路在CPH發(fā)生發(fā)展中占重要地位。eNOS是調(diào)控內(nèi)源性一氧化氮產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，VEGF能上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子濃度，促進(jìn)eNOS表達(dá)，介導(dǎo)一氧化氮生成，促進(jìn)血管增生。Western blot 結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織VEGF、eNOS蛋白表達(dá)及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值明顯升高，黃芪湯各劑量組大鼠肝組織VEGF、eNOS蛋白表達(dá)及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值明顯降低，表明黃芪湯的作用與調(diào)控VEGF/PI3K/Akt/eNOS信號通路密切相關(guān)。

綜上所述，黃芪湯可抑制VEGF/PI3K/Akt/eNOS信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)，降低血清VEGF含量，抑制肝竇毛細(xì)血管化，進(jìn)而發(fā)揮抗肝纖維化、肝硬化，降低門靜脈高壓的作用。