隔藥餅灸對動脈粥樣硬化易損斑塊兔RhoA/ROCK1信號通路及PI3K、Akt、mTOR表達的影響

饒澤華，吳雪芬，馬逸杰，廖意娟，宋家薇，易麗貞，劉欣，岳增輝

湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是以動脈內膜脂質沉積、纖維組織增生及炎性細胞浸潤為特征的慢性疾病。易損斑塊是AS中以大量泡沫細胞聚集及纖維帽變薄為特征的不穩(wěn)定斑塊，斑塊破裂形成血栓是心血管病致死的最主要原因，因此穩(wěn)定斑塊是防治AS的重要策略。巨噬細胞是斑塊中最主要的細胞，在AS后期，巨噬細胞凋亡可促進斑塊破裂。細胞自噬可促進巨噬細胞膽固醇轉出，維持細胞穩(wěn)態(tài)，減少脂質累積，從而穩(wěn)定斑塊。因此，調控細胞自噬可能是治療AS的新方向。研究表明，Ras 同源物基因組成員A（RhoA）/Rho 同源物相關卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）信號通路能調節(jié)肌動蛋白聚合及細胞骨架重排，對巨噬細胞吞噬、遷移等功能具有調節(jié)作用，通過多個途徑參與AS形成。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是調節(jié)細胞自噬的關鍵蛋白，磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）是mTOR上游的關鍵調節(jié)因子，抑制PI3K/Akt/mTOR 通路可誘導細胞自噬，而激活ROCK可使mTOR活化。隔藥餅灸通過在穴位上敷貼藥餅，借助艾灸的溫熱作用促進藥物吸收，更好地治療疾病。研究表明，隔藥餅灸可通過調節(jié)血脂水平影響AS 的發(fā)展進程，并通過抑制RhoA/ROCK1信號通路穩(wěn)定易損斑塊，但RhoA/ROCK1是否通過介導PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達，調節(jié)細胞自噬功能，目前并不清楚。因此，本研究觀察隔藥餅灸對AS 易損斑塊兔RhoA/ROCK1 信號通路及PI3K、Akt、mTOR表達的影響，深入研究其穩(wěn)定AS易損斑塊的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性新西蘭大耳白兔70只，體質量1 800～2 200 g，湖南太平生物科技有限公司提供，動物許可證號SYXK（湘）2020-0005。單籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，室溫25 ℃、濕度50%～70%環(huán)境，12 h明暗交替。本實驗經湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（LL2019081905）。造模用高脂飼料，湖南嘉泰實驗動物有限公司提供，由83.8%基礎飼料＋1%膽固醇＋10%蛋黃粉＋5%豬油＋0.2%丙基硫氧嘧啶組成。

1.2 藥物及制備

丹參、郁金、山楂、澤瀉、大黃藥粉，湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房提供，按等比例取3～5 g藥粉用陳醋調成糊狀，制成厚2～3 mm、直徑0.8～1.2 cm藥餅。Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾，上海源葉生物科技有限公司，貨號32087。阿托伐他汀鈣片，美國輝瑞公司，批號1237304。

1.3 主要試劑與儀器

艾炷（南陽昊翔藥業(yè)，5 mm×10 mm），斑點蝰蛇毒（廣西醫(yī)科大學蛇毒研究所制備），Ad5-p53重組載體（深圳賽百諾基因技術有限公司，批號20130602），組胺（上海三杰生物技術有限公司，批號20110901），烏拉坦（國藥集團化學試劑有限公司，批號20190419），載脂蛋白A（APO-A）ELISA試劑盒（江蘇晶美，貨號GR-E72284），載脂蛋白B（APO-B）ELISA試劑盒（江蘇晶美，貨號GR-E72285），RhoA抗體（湖南艾方生物科技有限公司，貨號AF03289），HE染色液、DAB顯色劑、ROCK1 抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號分別為G1005、G1211、GB11265）。導引導管（145 cm×0.84 mm）、球囊擴張導管[（3.0～3.5 mm）×15 mm]、手推式球囊擴張壓力泵（30 atm，1 atm＝101.325 kPa）、導引導絲（0.14 mm×195 cm），美國Cordis公司；臺式高速冷凍離心機（北京大龍儀器，型號D3024R）；立式冷藏陳列柜（浙江星星科技股份有限公司，型號LSC-316C）；臥式冷凍箱（合肥美菱公司，型號BCD-318AT）；高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號KZ-II）；超薄切片機（德國Leica公司，型號UC7）；酶標儀（美國Rayto公司，型號RT-6100）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司，型號alphaEase FC）；顯微鏡（日本Nikon公司，型號E100）。

1.4 分組及造模

參照Phinikaridou等研究，采用高脂飼料喂養(yǎng)＋腹主動脈球囊損傷＋基因轉染＋藥物觸發(fā)斑塊破裂的方法制備AS易損斑塊模型。所有動物適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為空白組10只和手術組60只，空白組予普通飼料喂養(yǎng)，手術組予高脂飼料喂養(yǎng)。2周后對手術組兔行腹主動脈球囊損傷術：耳緣靜脈注射20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉兔，肝素鈉200 U/kg 抗凝。將兔固定于兔臺，右后肢大腿內側剪毛備皮，絡合碘常規(guī)消毒，在股動脈搏動明顯處沿股動脈走行方向切開皮膚，游離右股動脈約2 cm，結扎股動脈遠心端，動脈夾夾閉近心端，在股動脈近心端穿線打一活結備用。將股動脈剪一小口，送入導引導絲，松開動脈夾，沿導引導絲將球囊導管導入腹主動脈，長度約20 cm。用球囊擴張壓力泵向球囊注入肝素鈉生理鹽水，并保持壓力泵讀數(shù)為6～8 atm，抗阻力牽拉球囊導管至髂動脈，抽空球囊，45 s后再次將球囊導管送入20 cm處，重復3次。術后結扎股動脈近心端，逐層縫合消毒，連續(xù)3 d 肌肉注射青霉素（40 萬U/d）預防感染。

手術過程死亡5只，剩余55只兔采用隨機數(shù)字表法分為模型組、直接灸組、隔藥餅灸組、西藥組和抑制劑組，每組11只。術后各組兔繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng)并進行相應干預，連續(xù)8周。

干預結束后停止高脂飼料喂養(yǎng)，改為普通飼料，對所有手術組兔進行腹主動脈斑塊局部基因轉染。選取左后肢大腿內側股動脈，術前準備及送入球囊導管操作同腹主動脈球囊損傷術，用球囊擴張壓力泵向腹主動脈局部注入滴度為1.0×10VP/mL的Ad5-p53重組載體20 μL，術后操作同前，基因轉染時間2周。

藥物觸發(fā)共2次，分別于動物處死前48、24 h腹膜下注射斑點蝰蛇毒（0.15 mg/kg），30 min后耳緣靜脈注射組胺（0.02 mg/kg），以誘發(fā)斑塊破裂。

1.5 干預方法

于腹主動脈球囊損傷術后對各組兔進行相應干預，具體操作為：空白組和模型組只固定，不干預，每次30 min，每日1次；直接灸組將兔固定于兔臺，剪毛，取穴定位參照《實驗針灸學》及擬人比照法制定，取穴分2組，1組“巨闕”、雙側“天樞”“豐隆”，2組雙側“心俞”“肝俞”“脾俞”，將直徑0.5 cm的艾炷（下有紙制墊盤）粘于穴位上，點燃施灸，待艾炷燃完且余熱散盡后，再換另一壯，每穴每日灸3 壯（約30 min），2組穴位隔日交替施灸；隔藥餅灸組將兔固定于兔臺，剪毛取穴定位，將提前制作好的藥餅貼于穴位上，將艾炷的墊盤去除后放置于藥餅上點燃施灸，其余操作同直接灸組；西藥組將阿托伐他汀鈣片研磨成粉，按1.96 mg/（kg·d）劑量拌入高脂飼料中，每日固定相同時間，不施灸；抑制劑組每日分2次經耳緣靜脈注射鹽酸法舒地爾10 mg/（kg·d），每日固定相同時間，不施灸。各組連續(xù)干預8周。

1.6 取材

取材前12 h禁食不禁水，耳緣靜脈注射20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉兔，仰臥固定于兔臺，腹部剪毛后，沿腹中線開腹，游離主動脈弓至髂總動脈分叉處主動脈全長，采血針平行血管進針，取動脈血2 mL于抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，將血清轉移至新的EP管，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采血完成后，用眼科剪將腹主動脈剪下，生理鹽水沖洗，剪取約2 cm腹主動脈置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定24 h以上，剩余腹主動脈置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 檢測指標

1.7.1 一般情況觀察

每日觀察兔精神狀態(tài)、動作靈敏性、反應敏捷性、毛發(fā)光澤度、體質量變化、飲食量、飲水量及大小便情況。

1.7.2 ELISA檢測

取離心后血清，ELISA檢測APO-A和APO-B含量，嚴格按試劑盒說明書操作，酶標儀波長450 nm處測量各孔吸光度（OD值），計算血清APO-A和APO-B含量。

1.7.3 HE染色

取出4%多聚甲醛固定的腹主動脈，蒸餾水沖洗，選取斑塊形成處進行脫水、浸蠟、包埋、切片（4 μm），石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，Harris蘇木素染色5 min，蒸餾水洗，1%鹽酸酒精分化30 s，蒸餾水洗，梯度乙醇脫水，伊紅染色5 min，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，采用MIASE圖像分析系統(tǒng)測量腹主動脈內膜、內膜-中膜厚度。

1.7.4 免疫組化檢測

取適量腹主動脈，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、抗原修復、過氧化氫滅活、血清封閉。滴加RhoA一抗（1∶100）、ROCK1一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜，滴加HRP標記山羊抗兔二抗（1∶200），室溫孵育50 min，DAB顯色，蘇木素襯染，沖洗、封片后，顯微鏡下觀察，采用Aipathwell圖像分析系統(tǒng)計算陽性表達的平均光密度。

1.7.5 Western blot檢測

取適量腹主動脈，加入裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，80 μg蛋白上樣，電泳后將蛋白轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入PI3K、Akt、mTOR一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，采用Quantity One 4.4.0軟件進行分析，以目的蛋白與內參蛋白灰度值比值計算目的蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 隔藥餅灸對模型兔一般情況的影響

最終存活50只兔，其中空白組8只、模型組9只、直接灸組9只、隔藥餅灸組7只、西藥組9只、抑制劑組8只。模型組兔精神狀態(tài)不佳，活動減少，毛發(fā)光澤度降低，體質量增加，大便顏色加深，小便混濁；各干預組兔精神狀態(tài)不佳，行動遲緩，其他無顯著差異。

2.2 隔藥餅灸對模型兔血清載脂蛋白A和載脂蛋白B含量的影響

與空白組比較，模型組兔血清APO-A含量顯著減少，APO-B含量顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，直接灸組、隔藥餅灸組和西藥組兔血清APO-A含量顯著增加（＜0.05，＜0.01），APO-B 含量顯著減少（＜0.05，＜0.01），抑制劑組兔血清APO-A含量顯著增加（＜0.01）；與直接灸組比較，隔藥餅灸組兔血清APO-B含量顯著減少（＜0.01）；與隔藥餅灸組比較，西藥組兔血清APO-B含量顯著增加（＜0.05）。見圖1。

圖1 各組兔載脂蛋白APO-A、APO-B含量比較（，每組7～9只）

2.3 隔藥餅灸對模型兔腹主動脈病理形態(tài)的影響

空白組兔腹主動脈血管內皮組織結構完整，內膜薄且緊貼內彈性板，中膜平滑肌細胞排列整齊；模型組兔腹主動脈內膜明顯增厚，可見大量泡沫細胞聚集，脂質累積形成斑塊，向管腔內凸起致管腔狹窄，纖維帽薄且脂核較大，斑塊內可見多處出血，管腔內可見血栓，中膜平滑肌細胞排列紊亂；直接灸組兔腹主動脈內膜增厚，有斑塊形成；隔藥餅灸組兔腹主動脈內膜可見泡沫細胞聚集，管腔內有斑塊，中膜平滑肌細胞結構紊亂，彈力纖維排列不規(guī)則；西藥組兔腹主動脈內膜明顯增厚，有斑塊形成，中膜平滑肌細胞排列整齊；抑制劑組兔腹主動脈內膜可見泡沫細胞聚集并形成斑塊，表層為厚薄不一的纖維帽，中膜結構紊亂，彈力纖維結構不清，管腔內可見少量不溶性纖維蛋白及紅細胞。見圖2。

圖2 各組兔腹主動脈形態(tài)（HE染色，×200）

與空白組比較，模型組兔腹主動脈內膜、內膜-中膜厚度顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，直接灸組、隔藥餅灸組和西藥組兔腹主動脈內膜、內膜-中膜厚度顯著減少（＜0.01，＜0.05）。見圖3。

圖3 各組兔腹主動脈內膜、內膜-中膜厚度比較（，每組7～9只）

2.4 隔藥餅灸對模型兔腹主動脈RhoA和ROCK1表達的影響

與空白組比較，模型組兔腹主動脈RhoA 和ROCK1表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，直接灸組、隔藥餅灸組、西藥組和抑制劑組兔腹主動脈RhoA和ROCK1表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（＜0.01）。見圖4～圖6。

圖4 各組兔腹主動脈RhoA表達（免疫組化染色，×400）

圖5 各組兔腹主動脈ROCK1表達（免疫組化染色，×400）

圖6 各組兔腹主動脈RhoA和ROCK1表達比較（，每組7～9只）

2.5 隔藥餅灸對模型兔腹主動脈PI3K、Akt、mTOR蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組兔腹主動脈PI3K、Akt、mTOR蛋白表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，隔藥餅灸組兔腹主動脈Akt、mTOR蛋白表達顯著降低（＜0.05，＜0.01），西藥組兔腹主動脈Akt蛋白表達顯著降低（＜0.05），抑制劑組兔腹主動脈PI3K、mTOR蛋白表達顯著降低（＜0.05），其余差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；與直接灸組比較，西藥組和抑制劑組兔腹主動脈PI3K蛋白表達顯著降低（＜0.01）；與隔藥餅灸組比較，抑制劑組兔腹主動脈PI3K蛋白表達降低（＜0.05）。見圖7、圖8。

圖7 各組兔腹主動脈PI3K、Akt、mTOR蛋白表達比較（，每組7～9只）

圖8 各組兔腹主動脈PI3K、Akt、mTOR蛋白免疫印跡

3 討論

AS典型病變是在大、中動脈局部出現(xiàn)內膜增厚、大量脂質沉積，由單核細胞衍生的巨噬細胞及平滑肌細胞通過攝取脂蛋白形成泡沫細胞，壞死的泡沫細胞及組織碎片形成病變深部糜粥樣柔軟部分，凸出于管腔表面，覆以較堅硬的纖維被膜，形成粥樣斑塊。不穩(wěn)定斑塊破裂后形成血栓堵塞血管可引發(fā)嚴重的急性心血管事件。易損斑塊具有較大的脂質核心、較多的巨噬細胞浸潤，以及薄的纖維帽。本實驗HE染色顯示，模型組兔腹主動脈部分斑塊脂核較大，可見大量巨噬細胞浸潤，纖維帽變薄，與易損斑塊特點基本一致，提示AS易損斑塊模型制備成功。隔藥餅灸組、西藥組兔腹主動脈損傷程度稍減輕，均未見血栓形成或出血，且內膜、內膜-中膜厚度顯著減少，提示干預后斑塊穩(wěn)定性增加。

脂質代謝紊亂與AS發(fā)生發(fā)展關系密切，APO-A和APO-B是評價血脂的重要指標，APO-B存在于所有致AS脂蛋白中，可直接反映致AS脂蛋白含量，與AS發(fā)展呈正相關。研究表明，低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）可導致AS，降低LDL-C含量可減少心血管事件的風險。APO-B是LDL-C的主要構成蛋白，降低APO-B含量可抑制AS形成。APO-A是高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）主要成分，參與激活卵磷脂膽固醇?；D移酶，并能結合周圍組織中的游離膽固醇，促進膽固醇逆轉運，減少脂質累積，抑制AS 的發(fā)展。本實驗結果顯示，模型組兔血清APO-A含量顯著減少，APO-B含量顯著增加，直接灸組、隔藥餅灸組和西藥組兔血清APO-A含量顯著增加，APO-B含量顯著減少，表明3種干預方法均可改善AS易損斑塊兔載脂蛋白含量，抑制AS發(fā)展。且在調節(jié)APO-B含量方面，隔藥餅灸效果最優(yōu)。

RhoA是超家族中單體小分子G蛋白的成員之一，ROCK1為RhoA下游的效應分子，RhoA/ROCK信號通路能調節(jié)肌動蛋白聚合和細胞骨架重排，激活ROCK可促進細胞黏附分子的分泌，增加巨噬細胞黏附聚集，促進AS 的發(fā)展。研究表明，抑制RhoA/ROCK可促進Beclin1激活下游自噬相關通路，增加自噬水平。本實驗結果顯示，模型組兔腹主動脈RhoA和RCOK1表達顯著升高，提示RhoA/ROCK1信號通路被激活，隔藥餅灸組兔腹主動脈RhoA和ROCK1表達顯著降低，表明隔藥餅灸干預可抑制RhoA/ROCK1信號通路，穩(wěn)定易損斑塊，延緩AS。

自噬是真核生物降解和回收利用細胞內生物大分子及受損細胞器的過程，巨噬細胞源性泡沫細胞通過誘導自噬促進膽固醇逆轉運、調節(jié)膽固醇流出、減少脂質累積，延緩AS斑塊形成。調控自噬可能是治療AS 的潛在方法。研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路能促進巨噬細胞自噬。趙瑞翔等也發(fā)現(xiàn)，抑制miR-1可顯著提高PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平，降低細胞Beclin1蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，抑制自噬小體形成，表明抑制miR-1表達可激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制細胞自噬。mTOR參與調節(jié)細胞生長、凋亡和自噬等，是自噬的關鍵蛋白。PI3K/Akt 是mTOR 上游的調節(jié)因子，活化的Akt使TSC1/2復合物解離，導致Rheb-GTP濃度增加，從而激活mTOR生成mTORC1，磷酸化自噬相關因子絲氨酸/蘇氨酸激酶1（ULK1），阻礙自噬小體形成，抑制細胞自噬。當mTORC1活性被抑制，ULK1去磷酸化形成ULK復合體啟動自噬。PI3K/Akt/mTOR信號通路在細胞自噬中發(fā)揮重要作用，且與AS關系密切。本實驗采用Western blot 檢測兔腹主動脈PI3K、Akt、mTOR蛋白表達，結果顯示，模型組兔腹主動脈PI3K、Akt、mTOR蛋白表達顯著升高，提示AS發(fā)生后PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活，細胞自噬水平下降。隔藥餅灸組兔腹主動脈Akt、mTOR蛋白表達降低，提示隔藥餅灸干預可抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，提高細胞自噬水平。同時，抑制劑組兔腹主動脈PI3K、mTOR 蛋白表達降低，表明抑制RhoA/ROCK1信號通路可降低PI3K、Akt、mTOR表達。

綜上所述，隔藥餅灸可能通過抑制RhoA/ROCK1信號通路，降低Akt、mTOR 蛋白表達，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進細胞自噬，改善血脂水平，減輕腹主動脈病理損傷，從而穩(wěn)定AS易損斑塊。