雙參芎連顆粒對動脈粥樣硬化大鼠細胞凋亡的影響

李然，謝朋呈，辛高杰，李磊，任建勛，劉建勛，付建華，2

1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100091；2.國家中醫(yī)心血管疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100091

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是動脈硬化的主要類型，常引起嚴重的心臟損害?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，AS病理基礎(chǔ)為血液高凝狀態(tài)、高纖維蛋白原血癥、高紅細胞壓積等血液流變異常，臨床常表現(xiàn)為胸痛、胸悶等胸部不適與頭暈、頭痛、言語活動障礙等先后或同時存在。有學(xué)者認為，高脂血癥也是心血管疾病的危險因素。課題組前期針對AS疾病本虛標實的病機特點，通過不同配伍研究，并按照現(xiàn)代中藥制劑要求對方藥制劑工藝和質(zhì)量標準進行優(yōu)化，最終擬定具有益氣活血、化痰解毒功效的雙參芎連顆粒。本實驗進一步觀察雙參芎連顆粒對AS模型大鼠細胞凋亡的影響，探討其改善AS作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠182只，體質(zhì)量（230±10）g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF 級屏障環(huán)境，溫度25 ℃，濕度60%，12 h光照/黑暗循環(huán)，自由攝食飲水。

1.2 藥物

雙參芎連顆粒（丹參、人參、川芎、黃連、澤瀉、山楂、神曲），藥材提取物由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所制備，批號20111012，1 g提取物相當于原藥材2.44 g，用蒸餾水配制成濃度分別為0.08、0.16、0.32 g/mL。丹蔞片，吉林康奈爾藥業(yè)，0.3 g/片，批號20110702，用蒸餾水配制成濃度為0.08 g/mL。辛伐他汀片（舒降之），杭州默沙東制藥有限公司，批號110594，20 mg/片，用蒸餾水配制成濃度為0.4 mg/mL。

1.3 主要試劑與儀器

總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒，安徽中生北控生物科技股份有限公司，批號均為20000271；高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）ELISA試劑盒，美國BD公司，批號36559；氧化型低密度脂蛋白膽固醇（ox-LDL-C）ELISA 試劑盒，美國MY BioSource公司，批號201120409。2.0F球囊導(dǎo)管，美國Fogarty 公司；MIKRO-22R 高速臺式冷凍離心機，德國Hettich公司；VX-380超低溫冰箱，法國JOUAN公司；Milli-Q 純水機，美國Merck Millipore 公司；RA-1000 全自動生化分析儀，德國Technicon 公司；SYNERGY-4酶標儀，美國Biotek公司；BX-41/BH-2光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS。

1.4 造模

182只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機挑選26只作為空白組，予普通飼料喂養(yǎng)，其余大鼠予高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)4周。第4周隨機從空白組和造模大鼠中各抽取10只心臟取血，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，分離血清，測定TC、LDL-C含量。確定造模大鼠TC、LDL-C含量明顯升高后，水合氯醛腹腔注射麻醉剩余造模大鼠，沿頸前正中線無菌切開皮膚，暴露頸前區(qū)左側(cè)頸總動脈，結(jié)扎遠心端，微動脈夾阻斷近心端，眼科剪剪一“V”字形切口，插入2.0F球囊導(dǎo)管（預(yù)先用1∶15稀釋的肝素鈉生理鹽水浸潤），插入深度15 cm，向球囊內(nèi)打入0.2～0.25 mL氣體，使其充分擴張至有阻力感，勻速回拉球囊8～10 cm，重復(fù)上述操作5次，操作完成后回抽球囊內(nèi)氣體，取出球囊導(dǎo)管，結(jié)扎左側(cè)頸總動脈近心端，無菌縫合切口，局部給予青霉素生理鹽水消毒。

1.5 分組及給藥

將手術(shù)大鼠隨機分為模型組、丹蔞片組（0.8 g/kg）、舒降之組（4 mg/kg）和雙參芎連顆粒低、中、高劑量組（原藥材2、4、8 g/kg），于手術(shù)后3 d灌胃給藥，給藥體積1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)8周，空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水。給藥期間除空白組外，其余各組大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。

1.6 取材

給藥結(jié)束后大鼠禁食12 h，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，75%醫(yī)用酒精消毒腹部皮膚，打開腹腔，腹主動脈取血，分離血清；取腹主動脈組織，置于10%中性福爾馬林固定，用于HE染色及免疫組化分析。

1.7 指標檢測

1.7.1 血清相關(guān)指標檢測

取5 mL 腹主動脈血，1 500 r/min 離心5 min，CHOD-PAP法檢測血清TC、TG含量，聚乙烯硫酸一步測沉淀法檢測LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量；ELISA檢測血清ox-LDL-C、hs-CRP含量。

1.7.2 HE染色

取固定的腹主動脈組織，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察腹主動脈病理變化。

1.7.3 免疫組化染色

腹主動脈組織石蠟切片于75 ℃烘箱中烤片85 min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ分別浸泡30 min脫蠟；100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ各浸泡10 min，95%酒精、85%酒精、80%酒精浸泡5 min水化；蒸餾水洗3次，每次2 min，PBS洗3次，每次5 min，置于枸櫞酸鈉溶液中高壓鍋煮沸，高壓120 s進行抗原修復(fù)；滴加Bcl-2、Bax一抗（1∶100），4 ℃冰箱過夜；次日室溫恢復(fù)30 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加二抗，室溫孵育45 min；PBS清洗，DAB顯色，蒸餾水沖洗2次；80%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ浸泡10 min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡10 min脫水透明，中性樹脂封片；于顯微鏡下觀察，以棕黃色顆粒為陽性表達，計算陽性表達的平均光密度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 雙參芎連顆粒對模型大鼠血清相關(guān)指標的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清TC、LDL-C、ox-LDL-C、hs-CRP水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，丹蔞片組、舒降之組和雙參芎連顆粒中、高劑量組大鼠血清TC、LDL-C、ox-LDL-C、hs-CRP水平顯著降低（＜0.05，＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清相關(guān)指標比較（）

2.2 雙參芎連顆粒對模型大鼠腹主動脈病理變化的影響

空白組大鼠腹主動脈管腔結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)皮完整，平滑肌細胞排列整齊，未見炎性細胞浸潤及脂質(zhì)沉積；模型組大鼠腹主動脈病灶表面纖維帽下可見大小不等的脂質(zhì)空泡，并有淋巴細胞及中性粒細胞等炎性細胞浸潤，中膜平滑肌細胞核固縮且排列紊亂，偶見內(nèi)彈性膜斷裂，并且隨著造模時間延長，AS斑塊面積略有增加；各給藥組大鼠腹主動脈斑塊內(nèi)炎性細胞浸潤減少，斑塊面積縮小，以丹蔞片組、舒降之組、雙參芎連顆粒高劑量組變化最為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠腹主動脈組織形態(tài)（HE染色，×100）

2.3 雙參芎連顆粒對模型大鼠腹主動脈組織Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠腹主動脈組織Bcl-2、Bax蛋白表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠腹主動脈組織Bcl-2 蛋白表達顯著升高（＜0.01），Bax 蛋白表達顯著降低（＜0.01）。見圖2、圖3、表2。

圖2 各組大鼠腹主動脈組織Bcl-2陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖3 各組大鼠腹主動脈組織Bax陽性表達（免疫組化染色，×200）

進一步比較Bcl-2/Bax比值變化，結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組Bcl-2/Bax比值顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組Bcl-2/Bax 比值顯著升高（＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠腹主動脈組織Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax比值比較（）

3 討論

AS是由脂質(zhì)驅(qū)動的中型動脈和主動脈慢性炎癥性疾病，首先是低密度脂蛋白和殘余脂蛋白顆粒積聚，其特征是動脈壁有纖維脂肪沉積。研究表明，AS與血管平滑肌細胞凋亡密切相關(guān)，在AS早期，血管平滑肌細胞容易發(fā)生凋亡。大部分間質(zhì)膠原纖維由血管平滑肌細胞生成，有助于增加纖維帽的抗拉強度，因此，平滑肌細胞凋亡可干擾AS斑塊的穩(wěn)定性。平滑肌細胞凋亡也會加重炎癥反應(yīng)，進一步增加斑塊的不穩(wěn)定性。血管壁細胞凋亡的靶向干預(yù)可為AS及其主要并發(fā)癥的治療提供方向。高脂血癥是以血清TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低為主要表現(xiàn)的全身脂代謝異常疾病，是導(dǎo)致AS，進而發(fā)展成為心腦血管疾病的主要危險因素之一。本研究采用高脂飲食及腹主動脈損傷結(jié)合的方法建立AS大鼠模型。高脂飲食喂養(yǎng)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，主要表現(xiàn)為大鼠血清TC、LDL-C水平升高，各給藥組大鼠血清TC、LDL-C水平不同程度降低，表明雙參芎連顆粒具有降血脂作用。由于大鼠可能對AS的形成具有一定抵抗力，因此本實驗采用腹主動脈球囊損傷破壞血管內(nèi)膜，加速血管中脂質(zhì)沉積，促進炎癥和AS斑塊形成。LDL-C是血液中的主要脂蛋白成分，氧化后可轉(zhuǎn)化為ox-LDL-C，并通過與巨噬細胞清道夫受體結(jié)合誘導(dǎo)脂質(zhì)吞噬，從而形成泡沫細胞并導(dǎo)致AS。hs-CRP是一種全身性炎癥反應(yīng)急性期的非特異性標志物，被認為是由慢性炎癥引發(fā)心血管疾病的獨立危險因素。本實驗中，模型組大鼠血清ox-LDL-C、hs-CRP水平顯著升高，結(jié)合腹主動脈病理觀察，表明有斑塊形成并伴有血管壁炎性細胞浸潤，給藥組大鼠血清ox-LDL、hs-CRP水平顯著降低，說明藥物干預(yù)可縮小斑塊，減輕炎癥反應(yīng)，與病理觀察結(jié)果一致。

細胞凋亡是AS病理過程的重要部分，AS斑塊除內(nèi)膜增厚和炎性細胞浸潤外，還存在大量細胞凋亡和基質(zhì)裂解現(xiàn)象。Bcl-2和Bax與細胞凋亡關(guān)系最為密切，Bcl-2通過與結(jié)合體Apof-1作用抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，而Bax作用與其相反。此外，Bcl-2通過其BH3結(jié)構(gòu)域與促凋亡Bax、Bak基因形成異二聚體，從而維持促凋亡成員在細胞內(nèi)的定位分布，保護細胞不進入凋亡程序。Bcl-2和Bax之間存在動態(tài)平衡，Bcl-2/Bax 比值升高時，細胞凋亡受到抑制，Bcl-2/Bax比值降低則促進細胞凋亡。本實驗中，模型組大鼠腹主動脈損傷部位血管組織Bcl-2、Bax蛋白表達升高（＜0.01），Bcl-2/Bax比值降低（＜0.01），表明炎癥誘導(dǎo)的細胞凋亡在AS發(fā)展中被激活，各給藥組大鼠腹主動脈組織Bax蛋白表達下調(diào)，Bcl-2蛋白表達上調(diào)，Bcl-2/Bax比值升高，表明藥物干預(yù)可不同程度抑制AS形成[11-12]。

AS屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“脈痹”等范疇。其病機為本虛標實，本虛主要表現(xiàn)為氣虛、陰虛、陽虛，標實主要表現(xiàn)為毒邪、痰濁、血瘀致心脈阻塞。針對AS“痰濁毒瘀”的病機演變，課題組擬祛痰化瘀組方雙參芎連顆粒，方中丹參、川芎、人參共行祛瘀通脈之功，澤瀉、山楂、神曲、黃連兼施化痰解毒之效。全方具有益氣活血、化痰解毒功效。

綜上所述，雙參芎連顆粒能調(diào)節(jié)AS大鼠脂質(zhì)代謝，抑制血管組織細胞過度凋亡，延緩AS發(fā)展，穩(wěn)定斑塊。其作用機制可能與降低大鼠血清TC、LDL-C、ox-LDL-C、hs-CRP水平，改善腹主動脈病理損傷，下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達有關(guān)。本研究結(jié)果可為雙參芎連顆粒進一步應(yīng)用于AS相關(guān)疾病的治療提供實驗依據(jù)。