基于UPLC-Q-TOF-MS分析下瘀血湯活性成分及其抗肝癌作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

鄧哲，歐陽(yáng)昭廣，龍紅萍，唐玲，朱文豪，孟繁穎，周思倩，懷家軒，田雪飛

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南中醫(yī)藥大學(xué)方證轉(zhuǎn)化湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，廣東 廣州 510182；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208

原發(fā)性肝癌發(fā)病隱匿、侵襲及轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、病程進(jìn)展迅速、預(yù)后差。中醫(yī)藥治療肝癌具備一定優(yōu)勢(shì)，研究顯示血瘀證是原發(fā)性肝癌最常見的基本證候。肝癌患者常出現(xiàn)脅腹部脹痛結(jié)塊、刺痛不移，舌質(zhì)黯紅、有瘀斑瘀點(diǎn)，舌下脈絡(luò)瘀曲，脈澀等。國(guó)醫(yī)大師周仲瑛認(rèn)為，血瘀是肝癌發(fā)病的重要病機(jī)，貫穿肝癌病程始終，也是促使癌毒形成的關(guān)鍵病理因素。下瘀血湯出自《金匱要略》，由大黃、桃仁、土鱉蟲組成，用于治療女子產(chǎn)后瘀血內(nèi)停致少腹疼痛。國(guó)醫(yī)大師周岱翰將其用于辨治消化系統(tǒng)腫瘤，認(rèn)為治療肝癌應(yīng)以活血化瘀為主，選方以下瘀血湯為先。近年研究表明，下瘀血湯可抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，且可輔助經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞（TACE）治療原發(fā)性肝癌。目前對(duì)于下瘀血湯的活性成分及其治療原發(fā)性肝癌作用機(jī)制尚未明確。本研究應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）對(duì)下瘀血湯的成分進(jìn)行分析鑒定，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探究下瘀血湯主要活性成分的作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路，闡明其抗肝癌作用機(jī)制，并運(yùn)用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，為下瘀血湯的深入研究與臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 藥物與細(xì)胞

下瘀血湯配方顆粒（按《金匱要略》原方配比，大黃∶桃仁∶土鱉蟲＝5∶1∶2，批號(hào)分別為1016935、1071233、1036473），廣東一方制藥有限公司。肝癌細(xì)胞HepG2和Huh-7細(xì)胞株，中國(guó)浙江美森細(xì)胞科技有限公司。

1.2 主要儀器與試劑

Agilent 1290UPLC-6540 accurate mass Q-TOF 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配置MassHunter 質(zhì)譜工作站），美國(guó)Agilent 公司；Biofuge primoR 臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；Milli-Q超純水制備儀，美國(guó)Millipore公司；XS105電子分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司。mRNA提取試劑盒（貨號(hào)DP501），北京天根生化科技有限公司；mRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)E047-01B），蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；胰蛋白酶（貨號(hào)CTCC-002-006）、DMEM 高糖培養(yǎng)基（貨號(hào)CTCC-002-008）、胎牛血清（貨號(hào)CTCC-002-001）、抗生素（貨號(hào)15240112），中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；色譜純乙腈、甲酸，自制超純水。

2 方法

2.1 下瘀血湯成分分析

2.1.1 供試品溶液制備

精密稱取下瘀血湯配方顆粒2.0 g，置50 mL錐形瓶中，分別加50%、70%、100%甲醇溶液30 mL，超聲溶解30 min，靜置后取2 mL溶液，室溫、8 000 r/min離心5 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，得樣品1 mL，置進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣分析。

2.1.2 色譜條件

Agilent Extend C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相A為水（含0.1%甲酸）、B為乙腈，梯度洗脫（見表1），流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

表1 下瘀血湯成分測(cè)定流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）

2.1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)用ESI-L Low Concentration Tuning Mix（G1969-85000）校正，采用正負(fù)離子分析模式，MRE掃描方式。一級(jí)掃描范圍：m/z 100～1 500；除溶劑氣為氮?dú)?；干燥氣溫?25 ℃，體積流量6.8 L/min；鞘氣溫度350 ℃；毛細(xì)管電壓4.0 kV；Fragment電壓110 V。二級(jí)質(zhì)譜Fragment電壓：10、20、40 kV；掃描范圍：m/z 100～1 000。

2.2 下瘀血湯成分潛在作用靶點(diǎn)收集

基于UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析得到的下瘀血湯化學(xué)成分信息，采用TCMSP（https://tcmsp-e.com/）進(jìn)行成分查詢及靶點(diǎn)收集。對(duì)于TCMSP未收錄成分，應(yīng)用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢SMILES號(hào)，再使用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行靶點(diǎn)補(bǔ)充，選擇評(píng)分高的靶點(diǎn)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）將靶點(diǎn)全稱轉(zhuǎn)化為基因簡(jiǎn)稱。

2.3 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以“primarylivercancer”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，查找相應(yīng)靶點(diǎn)，去掉假陽(yáng)性和重復(fù)靶點(diǎn)后，建立原發(fā)性肝癌靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。通過R語(yǔ)言軟件（https://www.r-project.org/）將下瘀血湯活性成分靶點(diǎn)和原發(fā)性肝癌靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，獲得下瘀血湯抗肝癌潛在靶點(diǎn)。采用Cytoscape3.8.2 軟件（https://cytoscape.org/）構(gòu)建下瘀血湯抗肝癌成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將潛在靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），設(shè)置物種為“Homo sapiens”，得到蛋白相互作用（PPI）關(guān)系，結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，應(yīng)用R語(yǔ)言軟件計(jì)算靶點(diǎn)互作頻次，并繪制柱狀圖。

2.5 GO功能及KEGG通路富集分析

將下瘀血湯抗肝癌靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1），設(shè)置物種為“Homo sapiens”，進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析。

2.6 分子對(duì)接

通過UniProt、PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心靶點(diǎn)蛋白CASP3、ESR1、MYC、PPARG的3D結(jié)構(gòu)，使用PyMOL軟件進(jìn)行蛋白修飾，去除水分子與小分子配體，保存為pdb格式。在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢下瘀血湯主要活性成分的2D結(jié)構(gòu)，采用Chem3D軟件對(duì)各成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化。采用AutoDock Vina軟件對(duì)活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，用結(jié)合能評(píng)價(jià)二者的結(jié)合能力。選取結(jié)合能較好的2個(gè)活性成分，借助PyMOL軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化繪圖。

2.7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.7.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠20只，體質(zhì)量270～300 g，雌雄各半，6～8周齡，購(gòu)自湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào)ZS-202107050003，動(dòng)物倫理編號(hào)LLBH-202106090001。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障級(jí)動(dòng)物房，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度50%～80%，12 h/12 h光暗循環(huán)，普通飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

2.7.2 血漿樣品制備

將大鼠隨機(jī)分為下瘀血湯含藥血清組和空白血清組，每組10只。下瘀血湯（大黃7.5 g，桃仁1.5 g，土鱉蟲3.0 g）換算成配方顆粒為2.0 g/劑，按臨床等效劑量的5倍給藥。下瘀血湯含藥血清組大鼠予0.18 g/d下瘀血湯灌胃，灌胃體積10 mL/kg?？瞻籽褰M予等量生理鹽水灌胃。每日2 次，連續(xù)5 d。取材前禁食12 h，末次給藥1 h后，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，無(wú)菌條件下腹主動(dòng)脈采血，常溫靜置，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上清液，過濾，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7.3 CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖

將 HepG2 和 Huh-7 細(xì)胞以 1×10個(gè)/mL 接種于 96孔板，每孔100 μL，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度含藥血清配制的細(xì)胞培養(yǎng)液，設(shè)置空白組、對(duì)照組及2.5%、5%、10%、15%、20%含藥血清組，每組6個(gè)復(fù)孔，加入相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)24 h，每孔加CCK8溶液10 μL（1/10培養(yǎng)基量），1 h后于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[（對(duì)照組OD值－給藥組OD值）÷（對(duì)照組OD值－空白組OD值）×100%]。

2.7.4 RT-qPCR檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2和Huh-7細(xì)胞以2×10個(gè)/mL接種于6孔板，每孔2 mL，設(shè)置對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5%CO、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入空白血清和20%下瘀血湯含藥血清培養(yǎng)48 h。提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行定量擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃15 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列見表2。采用2法計(jì)算基因表達(dá)量。

表2 各基因PCR引物序列

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 下瘀血湯活性成分

下瘀血湯UPLC-ESI-Q-TOF-MS正負(fù)離子流圖見圖 1。運(yùn)用 Agilent MassHunter Qualitative Analysis 工作站中的分子特征提?。∕FE）功能，根據(jù)化合物的相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜碎片離子信息，結(jié)合文獻(xiàn)[19-21]對(duì)成分進(jìn)行鑒定。鑒定出下瘀血湯49個(gè)活性成分，其中大黃28個(gè)、桃仁17個(gè)、土鱉蟲4個(gè)。見表3。

圖1 下瘀血湯UPLC-ESI-Q-TOF-MS正負(fù)離子流圖

表3 下瘀血湯成分鑒定和歸屬

3.2 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)分析

通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)共獲取原發(fā)性肝癌相關(guān)靶點(diǎn)15 711個(gè)。應(yīng)用R語(yǔ)言軟件將下瘀血湯活性成分靶點(diǎn)與肝癌相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，兩者取交集后獲得下瘀血湯抗肝癌潛在靶點(diǎn)63個(gè)。利用Cytoscape 3.8.2得到下瘀血湯抗肝癌成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)有82個(gè)節(jié)點(diǎn)、193條邊，平均度值4.7。預(yù)測(cè)得到下瘀血湯抗肝癌有效活性成分17個(gè)，其中大黃素甲醚、大黃素、亞油酸、棕櫚酸、蘆薈大黃素、山柰酚、沒食子酸、腺苷、尿嘧啶的度值＞5，度值≥2的成分占88.23%；交集靶點(diǎn)共63個(gè)，其度值≥2，其中NCOA2、PTGS1、GABRA1、F7、CASP3的度值≥5，度值≥3的靶點(diǎn)占30.15%。

圖2 下瘀血湯抗肝癌成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

3.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)得到下瘀血湯抗肝癌潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖3。該網(wǎng)絡(luò)共63個(gè)節(jié)點(diǎn)、250條邊，平均度值7.98。由于靶點(diǎn)DIO1、SLC7A7、PRSS1、SLC22A5、F7 未參與PPI 網(wǎng)絡(luò)，故予剔除。其中度值≥3的靶點(diǎn)占76.19%，度值＞10的靶點(diǎn)主要有CASP3、ESR1、PPARG、MYC、RELA、CYP1A1、MAPK8、 PGR、 AR、 CYP3A4、 GSTP1、 AHR、CYP1B1、 ICAM1、 IKBKB、 CCNB1、 GSTM1、NCOA1、SLC2A4等，將其作為下瘀血湯抗肝癌核心靶點(diǎn)，30個(gè)核心靶點(diǎn)見圖4。相互作用頻次較高的靶點(diǎn)有CASP3、ESR1、PPARG、MYC，表明下瘀血湯活性成分與其有較高的結(jié)合活性，提示這些靶點(diǎn)可能是下瘀血湯抗肝癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 下瘀血湯抗肝癌靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 基于PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅南吗鲅獪垢伟┖诵陌悬c(diǎn)

3.4 GO功能分析

對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析，從生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三方面進(jìn)行基因功能注釋，＜0.01的前20個(gè)條目見圖5。結(jié)果顯示，核心靶點(diǎn)分子功能主要涉及氧化還原酶活性、核受體反應(yīng)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、脂質(zhì)結(jié)合、激酶結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、整合素結(jié)合等；生物過程主要涉及激素反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、化學(xué)應(yīng)激的細(xì)胞反應(yīng)、激素水平的調(diào)節(jié)、節(jié)律過程、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、雌二醇反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、循環(huán)系統(tǒng)過程、上皮細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)等；細(xì)胞組分主要涉及膜筏、復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、復(fù)雜受體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)、線粒體外膜等。

圖5 下瘀血湯抗肝癌潛在靶點(diǎn)GO富集分析

3.5 KEGG通路富集分析

對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，選?。?.01的信號(hào)通路進(jìn)行可視化，見圖6。與肝癌發(fā)病相關(guān)的機(jī)制主要涉及化學(xué)致癌作用-受體活化、癌癥通路、乙型肝炎、鞘脂信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、癌癥的MicroRNAs、AMPK信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、緊密連接蛋白等。

圖6 下瘀血湯抗肝癌潛在靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

3.6 分子對(duì)接結(jié)果

將下瘀血湯抗肝癌17個(gè)活性成分與4個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（CASP3、ESR1、MYC、PPARG）進(jìn)行分子對(duì)接分析，結(jié)果見表4。結(jié)合能越小表示該活性成分與靶點(diǎn)蛋白的親和力越高，結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol表明成分與靶點(diǎn)親和活性較強(qiáng)。分子對(duì)接結(jié)果顯示，大部分活性成分與靶點(diǎn)結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol，表明下瘀血湯活性成分與4個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較好的親和力，其中兒茶素二聚體、大黃酚葡萄糖苷與CASP3、ESR1、MYC、PPARG的結(jié)合能＜-6.0 kcal/mol，且結(jié)合體構(gòu)象較穩(wěn)定，分子對(duì)接模式見圖7。

表4 下瘀血湯主要活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能（kcal/mol）

圖7 Procyanidin B1、Chrysophanol glucoside與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接模式

3.7 下瘀血湯含藥血清對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

不同濃度（2.5%、5%、10%、15%、20%）下瘀血湯含藥血清作用于HepG2和Huh-7細(xì)胞12 h后，與對(duì)照組比較，血清濃度在10%開始對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用，細(xì)胞增殖抑制率隨血清濃度升高而增加，在含藥血清濃度為20%時(shí)抑制效果最佳（＜0.01），并可抑制靶點(diǎn)CASP3、ESR1、PPARG、MYC 表達(dá)（＜0.01）。見圖8、圖9。

圖8 不同濃度下瘀血湯含藥血清的肝癌細(xì)胞增殖抑制率（，n＝6）

圖9 下瘀血湯含藥血清對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)表達(dá)的抑制作用（，n＝3）

4 討論

肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其高發(fā)病率、高死亡率、高惡性程度，以及臨床治療手段的缺乏，使探尋肝癌治療的新藥物、新靶點(diǎn)尤為迫切。肝癌與多種因素相關(guān)：持續(xù)肝炎病毒感染、長(zhǎng)期酒精攝取、長(zhǎng)時(shí)間接觸致癌劑黃曲霉素等，糖尿病、肥胖等代謝疾病也是誘發(fā)肝癌的危險(xiǎn)因素。大多數(shù)肝癌由慢性炎癥發(fā)展而來，病程通常由慢性肝病發(fā)展成肝纖維化，再到肝硬化，最后惡化形成肝癌。中醫(yī)認(rèn)為，肝纖維化-肝硬化-肝癌的病程是瘀血逐漸聚集形成毒結(jié)的表現(xiàn)。肝癌病機(jī)多為情志抑郁，氣機(jī)阻滯，血行不暢，導(dǎo)致氣滯血瘀；或由濕熱邪毒，或蟲蠱、酒毒為害日久，瘀血毒結(jié)聚于肝臟?！案尾匮钡纳硖匦詻Q定其病理狀態(tài)下易肝血瘀阻，故血瘀貫穿病程始終，其肝纖維化-肝硬化-肝癌的過程也佐證“血瘀”病機(jī)。國(guó)醫(yī)大師周岱翰認(rèn)為，肝癌病機(jī)不外肝氣郁結(jié)，氣滯血瘀，壅塞脈絡(luò)，無(wú)論初病、久病，活血化瘀是最常用之法，治療多以下瘀血湯為主方加減。下瘀血湯為《金匱要略》為婦人產(chǎn)后瘀血內(nèi)停致少腹疼痛而設(shè)，“產(chǎn)婦腹痛，法當(dāng)以枳實(shí)芍藥散，假令不愈者，此為腹中有干血著臍下，宜下瘀血湯主之；亦主經(jīng)水不利”。方中大黃入血分，逐瘀蕩熱，推陳致新；桃仁活血化瘀，且有潤(rùn)燥之功；土鱉蟲善開血閉，可攻干血，逐瘀破結(jié)。三藥合用，破血之功峻猛。因下瘀血湯有活血逐瘀、攻堅(jiān)破積之長(zhǎng)，故凡瘀血內(nèi)行、瘀阻經(jīng)絡(luò)之證均可因證施治，現(xiàn)代醫(yī)家將其辨證用于肝癌治療?，F(xiàn)代研究顯示了下瘀血湯治療肝癌的有效性。如王曜等研究顯示，用下瘀血湯加減治療原發(fā)性肝癌肝熱血瘀證TACE術(shù)后患者，可有效改善患者的肝功能和生活質(zhì)量，并減輕化療毒副反應(yīng)。張浩等通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，下瘀血湯可有效抑制肝癌細(xì)胞與裸鼠皮下移植瘤的增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

本研究應(yīng)用UPLC-ESI-Q-TOF-MS結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)明確下瘀血湯的有效成分，預(yù)測(cè)下瘀血湯抗肝癌的作用機(jī)制，并通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。UPLC-ESI-QTOF-MS鑒定出下瘀血湯49個(gè)化學(xué)成分，其中大黃28個(gè)、桃仁17個(gè)、土鱉蟲4個(gè)。成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)顯示，大黃中的沒食子酸、蘆薈苷、山柰酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酚葡萄糖苷，桃仁中的檸檬苦素、苦杏仁苷、兒茶素、棕櫚酸、β-谷甾醇乙酸酯、亞油酸，土鱉蟲中的腺苷、尿嘧啶為下瘀血湯潛在抗肝癌核心成分。山柰酚治療肝病-肝纖維化-肝癌前景良好，可通過多種抗氧化和抗凋亡機(jī)制保護(hù)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，降低肝臟微環(huán)境中的免疫炎癥反應(yīng)，防止細(xì)胞凋亡，還可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥和腫瘤生長(zhǎng)。兒茶素、苦杏仁苷對(duì)肝癌細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用。蘆薈大黃素可有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖與遷移，其機(jī)制與Src/STAT3信號(hào)通路相關(guān)。大黃素具有抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)凋亡，抑制腫瘤微環(huán)境血管新生等多重作用。大黃素甲醚可通過AMPK/Sp1/DNMT1信號(hào)通路上調(diào)miR-370誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。沒食子酸可通過抑癌基因p53抑制人肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡。棕櫚酸可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞膜流動(dòng)性和葡萄糖代謝，發(fā)揮抑制肝細(xì)胞癌進(jìn)展的作用。上述研究提示，下瘀血湯可能通過山柰酚、兒茶素、苦杏仁苷、蘆薈大黃素、大黃素等活性成分發(fā)揮抗肝癌作用。

核心靶點(diǎn)GO 和KEGG 通路富集分析結(jié)果中，PI3K-Akt是經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路，乙型肝炎是誘發(fā)肝癌的常見病因。肝癌具有男性多于女性的性別差異，激素水平可能是導(dǎo)致性別差異的關(guān)鍵因素。激活A(yù)MPK信號(hào)通路可通過抑制脂質(zhì)代謝抑制肝癌細(xì)胞增殖。cGMP-PKG信號(hào)通路對(duì)維持血管穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，激活cGMP-PKG信號(hào)通路可抑制腫瘤細(xì)胞血管生成，提示下瘀血湯可能通過該通路調(diào)控肝癌血管生成。緊密連接是上皮細(xì)胞間的黏連復(fù)合物，是腸屏障的重要組成部分，腸屏障的破壞會(huì)導(dǎo)致腸道致病菌透過腸屏障，通過腸-肝循環(huán)誘發(fā)肝癌。此外，通過抑制腫瘤細(xì)胞的缺氧、應(yīng)激、炎癥、激酶結(jié)合等反應(yīng)，可抑制肝癌的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。因此，下瘀血湯可能通過PI3K-Akt信號(hào)通路、激素水平、AMPK信號(hào)通路調(diào)控的脂質(zhì)代謝、cGMP-PKG信號(hào)通路調(diào)控的抗血管生長(zhǎng)、緊密連接調(diào)控的腸屏障，以及缺氧、應(yīng)激、炎癥、激酶結(jié)合等多途徑發(fā)揮抗肝癌作用。

下瘀血湯抗肝癌潛在靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選得到CASP3、ESR1、PPARG、MYC為下瘀血湯抗肝癌的關(guān)鍵潛在靶點(diǎn)。CASP3是腫瘤細(xì)胞凋亡的執(zhí)行蛋白，通過促進(jìn)CASP3活化可有效促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)，下瘀血湯中多種成分具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。對(duì)于肝癌發(fā)病的性別差異，ESR1是一個(gè)編碼雌激素受體，可抑制肝臟致癌并建立性別特異性基因表，下瘀血湯可能通過ESR1調(diào)節(jié)激素水平，影響肝癌發(fā)病的性別差異。PPARG是過氧化物酶體增殖物激活的受體，PPARG的多態(tài)性可能會(huì)影響肝細(xì)胞癌的易感性，PPAR可通過鞘脂通路調(diào)控癌細(xì)胞凋亡，下瘀血湯可能通過抑制PPARG受體活化促進(jìn)凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。MYC是最常見的活化原癌基因之一，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，MYC過表達(dá)可誘導(dǎo)侵襲性肝腫瘤，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移形成，下瘀血湯可能通過作用于MYC抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。分子對(duì)接結(jié)果顯示，下瘀血湯主要活性成分與上述靶點(diǎn)蛋白具有較好的親和力，其中大黃酚葡萄糖苷和兒茶素二聚體的結(jié)合能力最佳，提示下瘀血湯可能通過大黃酚葡萄糖苷和兒茶素二聚體抑制4個(gè)靶點(diǎn)，發(fā)揮抗肝癌作用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確了下瘀血湯對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用，以及對(duì)4個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)表達(dá)的抑制作用。

綜上所述，本研究基于UPLC-ESI-Q-TOF-MS技術(shù)分析鑒定了下瘀血湯的化學(xué)成分，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提示山柰酚、兒茶素、苦杏仁苷、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚葡萄糖苷等是其發(fā)揮抗肝癌作用的主要活性成分。下瘀血湯抗肝癌的作用機(jī)制主要與PI3K-Akt信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)、激素水平調(diào)節(jié)、cGMP-PKG信號(hào)通路調(diào)控的抗血管生成、緊密連接調(diào)控的腸屏障、腫瘤細(xì)胞的缺氧、應(yīng)激、激酶結(jié)合等途徑相關(guān)。CASP3、ESR1、PPARG、MYC是下瘀血湯抗肝癌的潛在核心靶點(diǎn)，分子對(duì)接顯示大黃酚葡萄糖苷、兒茶素二聚體與4個(gè)靶點(diǎn)蛋白有較好的親和活性。最后通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了下瘀血湯抑制肝癌細(xì)胞增殖的能力，以及對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)表達(dá)的抑制作用。本研究可為進(jìn)一步闡明下瘀血湯抗肝癌的活性成分及作用機(jī)制提供研究方向和數(shù)據(jù)支持。