不同品種肉桂中酚類物質(zhì)抗氧化和抑制糖消化酶活性比較研究

劉瑤瑤， 鐘賽意， 李會(huì)鵬， 王衛(wèi)飛， 黎爾納， 龐道睿,*，廖森泰， 鄒宇曉,*

(1.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院， 廣東 湛江 524088； 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心， 廣東 廣州 510610)

肉桂(CinnamomumcassiaPresl)是一種樟科樟屬多年生喬木植物，廣泛種植于廣東、廣西、海南、臺(tái)灣和云南等緯度低、日照充足的山區(qū)或丘陵地區(qū)，因具有特殊的香味而被用作食品調(diào)味料。肉桂含有酚酸、黃酮、揮發(fā)油以及多糖等生物活性成分，具有抗氧化、降血糖、抗炎、抑菌防腐和抗腫瘤等多種健康效應(yīng)[1]。

糖尿病是一種由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的以高血糖為特征的慢性代謝紊亂疾病[2]。抑制人體消化酶是治療糖尿病的手段之一，有效抑制消化酶的活性可減緩餐后血糖水平的提高[3]。天然產(chǎn)物兼具結(jié)構(gòu)和生物活性的多樣性，在抑制糖消化酶活性中發(fā)揮著重要作用[4]，而肉桂的降血糖活性已逐漸引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。有研究表明，肉桂酚酸和黃酮類成分可能具有α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性，但不同的研究結(jié)果之間存在較大差異[5-6]，推測(cè)原料品種的不同可能是導(dǎo)致差異的原因之一[7-8]。目前關(guān)于比較不同品種肉桂對(duì)糖消化酶抑制活性的影響并探究其物質(zhì)基礎(chǔ)的研究仍鮮有報(bào)道，因此，考察品種對(duì)肉桂原料中酚類成分組成及其抗氧化、抑制糖消化酶活性的影響，探明其內(nèi)在聯(lián)系和規(guī)律具有一定的意義。本實(shí)驗(yàn)擬以臺(tái)灣土肉桂、清化肉桂、云野肉桂和西江肉桂4個(gè)生產(chǎn)主栽品種為研究對(duì)象，比較不同品種肉桂酚類物質(zhì)的含量及其抗氧化、抑制糖消化酶活性的差異，探究其活性物質(zhì)與酶半數(shù)抑制濃度的相關(guān)性，以抗氧化活性和抑制糖消化酶活性為指標(biāo)，希望篩選出優(yōu)質(zhì)的肉桂品種，并通過UHPLC-MS/MS分析產(chǎn)生糖消化酶抑制活性的化合物，以期為肉桂的精深加工和功能食品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臺(tái)灣土肉桂、清化肉桂、云野肉桂和西江肉桂4個(gè)品種均由廣西林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)林研究所提供。秋季肉桂采收期收獲，新鮮肉桂皮經(jīng)55 ℃熱風(fēng)干燥48 h后用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，得到肉桂干粉，室溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

水溶性維生素E(Trolox)、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)、熒光素鈉鹽、α-D-葡萄糖苷酶、對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、α-淀粉酶和小鼠腸丙酮粉，美國Sigma公司；沒食子酸、兒茶素和阿卡波糖，上海阿拉丁試劑公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SB- 1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會(huì)社公司；UV- 2450型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津有限公司；TECAN infinite 200型酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；QTRAP 6500+型液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，美國AB-SCIEX公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1不同品種肉桂游離態(tài)多酚粗提物的制備

采用溶劑提取法[9]制備肉桂游離態(tài)多酚粗提物。稱取不同品種肉桂粉10 g，按料液比1∶30(g∶mL)加入300 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，70 kHz超聲提取0.5 h，在5 000 r/min，4 ℃下離心10 min，收集上清液，殘?jiān)貜?fù)提取兩次，合并上清液。于45 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇溶劑，定容至25 mL，貯存于-20 ℃冰箱，備用。

1.3.2不同品種肉桂結(jié)合態(tài)多酚粗提物的制備

采用氫氧化鈉消化法[10]制備肉桂結(jié)合態(tài)多酚粗提物。室溫下向1.3.1得到的肉桂殘?jiān)屑尤? mol/L NaOH溶液15 mL，消化并震蕩90 min，用鹽酸將消化后樣品的pH值調(diào)節(jié)到2.0，并用乙酸乙酯萃取5次。將乙酸乙酯萃取液合并后，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用蒸餾水定容至10 mL，置于-20 ℃冰箱，備用。

1.3.3多酚粗提物中酚類物質(zhì)含量的測(cè)定

采用福林酚法[11]測(cè)定肉桂多酚含量。取待測(cè)樣品0.5 mL于干凈的試管，加入2 mL去離子水、0.5 mL福林酚試劑，混勻靜置6 min，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的Na2CO3溶液中和，加入4 mL去離子水混勻，室溫放置90 min，于760 nm處測(cè)定其吸光度值。以0.025～0.600 mg/mL沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下測(cè)定吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.458 7x+0.076 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。肉桂多酚含量以單位質(zhì)量(g)肉桂干樣品中所含沒食子酸當(dāng)量(mg)計(jì)，mg/g。

1.3.4多酚粗提物中黃酮類物質(zhì)含量的測(cè)定

采用硼氫化鈉- 四氯苯醌法[12]測(cè)定肉桂黃酮含量。取待測(cè)樣品1 mL，用氮?dú)獯蹈珊?，加? mL體積比為1∶1的四氫呋喃- 乙醇混合溶液復(fù)溶。加入0.5 mL 50 mmol/L的NaBH4溶液和0.5 mL 74.6 mmol/L的AlCl3溶液，室溫震蕩30 min，再加入0.5 mL 50 mmol/L的NaBH4溶液，重復(fù)震蕩30 min。加入2 mL提前預(yù)冷的8 mmol/L的冰乙酸溶液，避光反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后，加入1 mL 20 mmol/L的四氯對(duì)醌溶液。將各試管放入95 ℃的油浴鍋中油浴1 h，再用自來水冷卻，用甲醇精確定容至4 mL。向各試管中加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%的香草醛甲醇溶液和2 mL濃鹽酸，混勻，遮光反應(yīng)15 min。反應(yīng)結(jié)束后，離心，取上清液于490 nm處測(cè)定吸光度值。以0.000 3～0.008 0 mol/L兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下測(cè)定吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.000 5x+0.185，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。黃酮含量以單位質(zhì)量(g)肉桂干樣品中所含兒茶素當(dāng)量(mg)計(jì)，mg/g。

1.3.5體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 ORAC抗氧化活性測(cè)定

參照Feng等[13]的方法。待測(cè)樣品用磷酸鹽緩沖液稀釋，并加入96孔板中，于37 ℃孵育10 min，加入熒光素鈉鹽，于37 ℃孵育20 min，最后加入AAPH激發(fā)液。采用熒光酶標(biāo)儀(激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm)測(cè)定熒光衰減情況。ORAC值以單位質(zhì)量(g)肉桂干樣品中所含Trolox的物質(zhì)的量(μmol)表示，μmol/g。

1.3.5.2 羥自由基清除能力測(cè)定

參考姚宏亮等[14]的方法。分別取0.4 mg/mL待測(cè)樣品，按試劑盒所標(biāo)明操作方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用相同濃度的維生素C作陽性對(duì)照，按式(1)計(jì)算羥自由基(·OH)的清除率。

(1)

式(1)中：Aa為對(duì)照組吸光度，Ab為樣品組吸光度。

1.3.5.3 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

(2)

式(2)中：Aa為對(duì)照組吸光度，Ab為樣品組吸光度。

1.3.6糖消化酶抑制活性的測(cè)定

1.3.6.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

參考Jiang等[16]的方法，并略加修改。取50 μL系列稀釋濃度的待測(cè)樣品于96孔板，加入50 μL 10 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液(pH值為6.8，0.1 mol/L PBS配制)，于37 ℃恒溫孵育10 min。繼續(xù)加入50 μL 0.5 mmol/L p-NPG，37 ℃恒溫孵育20 min，放入冰水浴5 min降低酶活，再加入50 μL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，于405 nm處測(cè)定其吸光度值。以阿卡波糖為陽性對(duì)照，按式(3)計(jì)算α-葡萄糖苷酶活性抑制率。

(3)

式(3)中：Aa為樣品組吸光度，Ab為樣品背景組吸光度(等體積緩沖液替代酶液)，Ac為對(duì)照組吸光度(等體積緩沖液替代樣品液)，Ad為對(duì)照背景組吸光度(等體積緩沖液替代樣品和酶液)。

1.3.6.2 α-淀粉酶抑制活性的測(cè)定

參考Jiang等[16]的方法，并略加修改。取50 μL系列稀釋濃度的待測(cè)樣品于離心管中，加入50 μL 10 U/mL α-淀粉酶溶液(pH值為7，0.1 mol/L PBS配制)，在37 ℃恒溫孵育10 min。隨后加入50 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的淀粉溶液，按照1.3.6.1方法孵育20 min，冰水浴5 min，再加入100 μL DNS，沸水浴5 min，冷卻后于540 nm處測(cè)定其吸光度，以阿卡波糖為陽性對(duì)照，按式(3)計(jì)算α-淀粉酶活性抑制率。

1.3.6.3 鼠源二糖酶抑制活性的測(cè)定

參考Li等[17]的方法。取20 μL系列稀釋濃度的待測(cè)樣品于96孔板中，加入50 μL麥芽糖酶和蔗糖酶(鼠小腸丙酮粉配置)，加入56 mmol/L的蔗糖溶液或7 mmol/L的麥芽糖溶液50 μL啟動(dòng)反應(yīng)，在37 ℃反應(yīng)30 min。隨后加入50 μL 0.05 mol/L的Tris-HCl溶液終止反應(yīng)。以阿卡波糖為陽性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液(pH值為6.8)代替樣品作為空白對(duì)照，磷酸鹽緩沖液代替酶液作為對(duì)照組，采用葡萄糖測(cè)定試劑盒測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)生的葡萄糖的含量。按式(5)計(jì)算二糖酶活性抑制率。

(5)

式(5)中：Aa為對(duì)照組吸光值，Ab為樣品組吸光值，Ac為空白對(duì)照組吸光值。

1.3.7游離態(tài)多酚粗提物多酚化合物分析

基于不同品種肉桂游離酚和結(jié)合酚粗提物對(duì)糖消化酶的抑制活性比較，進(jìn)一步采用UHPLC-MS/MS[18-21]對(duì)不同品種肉桂游離態(tài)多酚粗提物酚類化合物進(jìn)行定性和定量分析。肉桂游離態(tài)多酚粗提物經(jīng)真空冷凍干燥后，研磨(30 Hz，1.5 min)至粉末狀。稱取不同品種肉桂凍干粉50 mg，按料液比1∶10(mg∶μL)加入500 μL體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇水溶液(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的鹽酸)，超聲5 min，在12 000 r/min，4 ℃下離心3 min，收集上清液，重復(fù)提取1次，合并兩次上清液，過膜，用于UHPLC-MS/MS分析。

色譜條件：采用Acquity UPLC BEH C18型色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。流動(dòng)相：A為超純水(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸)，B相為甲醇(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸)；梯度洗脫(0 min，體積分?jǐn)?shù)為5%的B；6 min，體積分?jǐn)?shù)為50%的B；12 min，體積分?jǐn)?shù)為95%的B保持2 min；14 min，體積分?jǐn)?shù)為5%的B平衡2 min)；流速0.35 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(electrospray lonization，ESI)，收集正離子模式數(shù)據(jù)。離子源溫度550 ℃，氣簾氣(curtain gas，CUR)35psi；正離子模式下噴霧電壓5 500 V。在Q-Trap6500+中，每個(gè)離子對(duì)是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(declustering potential，DP)和碰撞能(collision energy，CE)進(jìn)行掃描檢測(cè)。

質(zhì)譜分析：通過數(shù)據(jù)庫MWDB(metware database)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行定性分析；利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)鑒定的化合物進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到相應(yīng)的半數(shù)抑制濃度(IC50)值；用Duncan’s多重比較方法進(jìn)行顯著性方差分析。相關(guān)性采用Pearson Correlation法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種肉桂中酚類物質(zhì)含量比較

不同品種肉桂中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚類化合物含量分析結(jié)果見圖1。由圖1(a)可知，4個(gè)不同品種肉桂的游離態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚含量變幅介于55.99～66.57 mg/g和3.15～5.04 mg/g，所有品種中游離態(tài)多酚含量都明顯高于結(jié)合態(tài)多酚。4個(gè)品種肉桂中，臺(tái)灣土肉桂和清化肉桂的游離態(tài)多酚含量顯著高于其他兩個(gè)品種(P<0.05)。4個(gè)品種肉桂中，臺(tái)灣土肉桂的結(jié)合態(tài)多酚的含量最高[(5.04±0.19)mg/g]，并且顯著高于其他品種肉桂(P<0.05)。

不同字母表示各組數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)。

由圖1(b)可知，4個(gè)不同品種肉桂的游離黃酮和結(jié)合黃酮含量介于42.57～51.9 mg/g和2.82～6.15 mg/g，所有品種中游離態(tài)黃酮含量明顯高于結(jié)合態(tài)黃酮含量。臺(tái)灣土肉桂游離態(tài)黃酮含量最高，為(51.90±0.57)mg/g，顯著高于清化肉桂和云野肉桂(P<0.05)。臺(tái)灣土肉桂的結(jié)合態(tài)黃酮的含量最高[(6.15±0.86)mg/g]，顯著高于其他品種(P<0.05)。

由圖1(a)和(b)可知，所有品種中游離態(tài)多酚和黃酮含量明顯高于結(jié)合態(tài)多酚和黃酮含量。不同品種肉桂總多酚和總黃酮的含量亦存在顯著性差異(P<0.05)。臺(tái)灣土肉桂的總多酚和總黃酮含量最高，分別為(71.62±0.40)mg/g和(58.05±1.42)mg/g。

本研究結(jié)果表明，品種對(duì)肉桂中酚類物質(zhì)含量影響顯著。品種差異以及氣候、光照強(qiáng)度、土壤類型等因素都會(huì)影響植物原料中的生物活性物質(zhì)組成及含量[22]；此外活性物質(zhì)含量還與提取溫度、時(shí)間、pH值和溶劑極性等因素有關(guān)[23]。研究中所用肉桂的產(chǎn)地、提取方法、生長年限、采收部位基本一致?？梢耘袛啵煌贩N是造成肉桂酚類物質(zhì)含量存在差異的主要原因。

2.2 不同品種肉桂體外抗氧化活性比較

不同品種肉桂游離態(tài)和結(jié)合態(tài)粗提物的ORAC抗氧化活性分析結(jié)果見圖2。由圖2(a)可知，不同品種肉桂中游離態(tài)多酚粗提物ORAC值都明顯高于結(jié)合態(tài)多酚粗提物。臺(tái)灣土肉桂游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚粗提物氧自由基吸收能力最強(qiáng)，并且顯著高于其他品種(P<0.05)，分別為(923.84±18.95)μmol/g和(36.67±7.44)μmol/g。

不同字母表示各組數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)。

本研究結(jié)果表明，不同品種肉桂抗氧化活性存在顯著性差異，酚類物質(zhì)含量的不同可能是造成差異的主要原因。多酚復(fù)雜芳環(huán)結(jié)構(gòu)可以通過終止鏈?zhǔn)椒磻?yīng)有效地使活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)失活[24]。肉桂粗提物通過清除過氧自由基、羥自由基和超氧陰離子進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用。

2.3 不同品種肉桂游離態(tài)和結(jié)合態(tài)粗提物對(duì)糖消化酶抑制活性比較

α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、二糖酶是與碳水化合物消化吸收有關(guān)的幾種酶[25]。本研究用半數(shù)抑制濃度(IC50)評(píng)價(jià)肉桂游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚粗提物對(duì)碳水化合物消化過程中抑制腸道消化酶類活性的影響，IC50值越小，表明其對(duì)糖消化酶抑制活性越強(qiáng)。

2.3.1對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性比較

不同品種肉桂游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚粗提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用分析結(jié)果見圖3。由圖3(a)可知，4個(gè)品種肉桂游離態(tài)多酚粗提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果均顯著優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。臺(tái)灣土肉桂在4個(gè)品種游離態(tài)多酚粗提物中活性最強(qiáng)，顯著優(yōu)于其他品種(P<0.05)，IC50值為(1.87±0.05)g/L。由圖3(b)可知，清化肉桂結(jié)合態(tài)多酚粗提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用顯著高于其他品種(P<0.05)，IC50值為(68.51±0.61)g/L。其次分別為臺(tái)灣土肉桂[(76.88±1.20)g/L]、西江肉桂[(103.58±2.40)g/L]和云野肉桂[(114.92±1.11)g/L]，與陽性對(duì)照組對(duì)比，差異顯著(P<0.05)。本研究結(jié)果表明，不同品種肉桂中游離態(tài)多酚粗提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果都明顯優(yōu)于結(jié)合態(tài)多酚粗提物。

不同字母表示各組數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)。

2.3.2對(duì)α-淀粉酶抑制活性比較

不同品種肉桂游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚粗提物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用分析結(jié)果見圖4。由圖4(a)可知，對(duì)照組對(duì)α-淀粉酶的抑制效果顯著優(yōu)于4個(gè)品種肉桂游離態(tài)多酚粗提物(P<0.05)。4個(gè)不同品種肉桂游離態(tài)多酚粗提物對(duì)α-淀粉酶的抑制效果由高到低依次為西江肉桂[(24.82±3.66)g/L]、臺(tái)灣土肉桂[(38.06±7.01)g/L]、云野肉桂[(62.19±0.49)g/L]、清化肉桂[(86.95±11.13)g/L]。由圖4(b)可知，臺(tái)灣土肉桂和清化肉桂結(jié)合態(tài)多酚粗提物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用顯著高于其他品種(P<0.05)，IC50值分別為(405.31±13.95)g/L和(424.81±2.14)g/L。對(duì)照組對(duì)α-淀粉酶的抑制作用顯著優(yōu)于臺(tái)灣土肉桂和清化肉桂結(jié)合態(tài)多酚粗提物(P<0.05)。本研究結(jié)果表明，對(duì)照組對(duì)α-淀粉酶的抑制效果優(yōu)于肉桂游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚粗提物。

不同字母表示各組數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)。

2.3.3對(duì)二糖酶抑制活性比較

2.3.3.1 對(duì)麥芽糖酶抑制活性比較

不同品種肉桂游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚粗提物對(duì)麥芽糖酶的抑制作用見圖5。由圖5(a)可知，對(duì)照組對(duì)麥芽糖酶的抑制效果顯著優(yōu)于4個(gè)品種肉桂游離態(tài)多酚粗提物(P<0.05)。臺(tái)灣土肉桂和清化肉桂對(duì)麥芽糖酶的抑制效果顯著優(yōu)于其他兩個(gè)品種(P<0.05)，IC50值分別為(19.51±0.68)g/L和(21.92±1.34)g/L。如圖5(b)可知，云野肉桂結(jié)合態(tài)多酚粗提物對(duì)麥芽糖酶的抑制作用顯著高于其他品種(P<0.05)，IC50值為(506.72±12.91)g/L。西江肉桂結(jié)合態(tài)多酚粗提物對(duì)麥芽糖酶的抑制作用最低，IC50值為(651.49±8.31)g/L，4個(gè)品種肉桂結(jié)合態(tài)多酚粗提物對(duì)麥芽糖酶的抑制活性與對(duì)照組相比，差異均顯著(P<0.05)。對(duì)照組對(duì)麥芽糖酶的抑制效果優(yōu)于肉桂游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚粗提物。

不同字母表示各組數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)。

2.3.3.2 對(duì)蔗糖酶抑制活性比較

不同品種肉桂游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚粗提物對(duì)蔗糖酶的抑制作用見圖6。由圖6(a)可知，臺(tái)灣土肉桂、清化肉桂、云野肉桂和西江肉桂游離態(tài)多酚粗提物對(duì)蔗糖酶IC50值分別為(19.51±0.68)、(21.92±1.34)、(29.51±1.41)、(45.65±2.37)g/L。與對(duì)照組相比，4個(gè)品種肉桂游離態(tài)多酚粗提物的抑制效果顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。臺(tái)灣土肉桂游離態(tài)多酚對(duì)蔗糖酶的抑制作用顯著高于其他品種(P<0.05)。如圖6(b)可知，4個(gè)不同品種肉桂結(jié)合態(tài)多酚粗提物對(duì)蔗糖酶的抑制效果由高到低依次為臺(tái)灣土肉桂[(280.31±7.79)g/L]、清化肉桂[(454.42±14.66)g/L]、云野肉桂[(624.43±7.21)g/L]、西江肉桂[(964.94±30.93)g/L]，4個(gè)品種肉桂結(jié)合態(tài)多酚粗提物對(duì)蔗糖酶的抑制活性與對(duì)照組相比，差異均顯著(P<0.05)。本研究結(jié)果表明，對(duì)照組對(duì)蔗糖酶的抑制效果優(yōu)于肉桂游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚粗提物。

不同字母表示各組數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)。

通過研究4種肉桂的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚粗提物對(duì)多種糖消化酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)肉桂游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚粗提物均具有抑制糖消化酶的活性；且不同品種肉桂中游離態(tài)多酚粗提物對(duì)糖消化酶的抑制活性都明顯高于結(jié)合態(tài)多酚粗提物。通過比較發(fā)現(xiàn)，臺(tái)灣土肉桂較其他3個(gè)品種肉桂表現(xiàn)出更強(qiáng)的糖消化酶抑制活性。

2.4 相關(guān)性分析

肉桂酚類物質(zhì)含量與抑制糖消化酶活性的相關(guān)性分析結(jié)果見表1。由表1可知，α-葡萄糖苷酶IC50值與游離態(tài)多酚、結(jié)合態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)黃酮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，R2位于-0.709～-0.915(P<0.01)，即游離多酚、結(jié)合多酚和結(jié)合黃酮含量越高，IC50值越低，α-葡萄糖苷酶抑制活性越強(qiáng)；α-葡萄糖苷酶IC50值與游離態(tài)黃酮含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.679(P<0.05)；此外，蔗糖酶IC50值與結(jié)合態(tài)多酚和黃酮含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)，R2分別為-0.876和-0.948；α-淀粉酶IC50值與結(jié)合態(tài)多酚含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，R2為-0.604；麥芽糖酶IC50與游離態(tài)多酚、結(jié)合態(tài)多酚、游離態(tài)黃酮和結(jié)合態(tài)黃酮含量的R2均小于0.4，可認(rèn)為呈弱相關(guān)。該結(jié)果表明，肉桂粗提物對(duì)麥芽糖酶抑制活性不僅取決于多酚和黃酮含量，也可能與其他活性成分(如多糖或皂苷)有關(guān)[26-27]。本研究結(jié)果表明，肉桂多酚和黃酮具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和蔗糖酶抑制活性，而對(duì)麥芽糖酶無抑制活性。

表1 肉桂酚類物質(zhì)與其抑制糖消化酶活性相關(guān)性分析

2.5 多酚粗提物酚類化合物分析

不同品種肉桂游離態(tài)多酚粗提物黃酮類化合物分析結(jié)果見表2。黃酮類物質(zhì)可能是植物抑制α-葡萄糖苷酶重要活性物質(zhì)基礎(chǔ)[28]。由于肉桂游離酚粗提物中成分較多，深入分析發(fā)現(xiàn)：肉桂粗提取物中黃酮含量與α-葡萄糖苷酶的抑制活性顯著相關(guān)(R2=-0.679)。因此，黃酮類物質(zhì)可能是肉桂粗提物中抑制α-葡萄糖苷酶的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。分析肉桂中黃酮組成(表2)，共鑒定出40種肉桂酚類化合物，原花青素A2、原花青素B1、原花青素B2、原花青素B3、原花青素C1、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和蘆丁是其主要成分。有研究表明，黃酮的生物活性可能與黃酮骨架A、B和C環(huán)上羥基的數(shù)量和位置密切相關(guān)[29]。原花青素類結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，其黃酮骨架上A環(huán)上的5位羥基和B環(huán)上的羥基數(shù)目可能是其對(duì)α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制活性的原因[30-31]。原花青素類物質(zhì)在4個(gè)品種中含量都很高，所以是不同品種肉桂抑制糖消化酶的主要活性物質(zhì)之一，從而使4個(gè)品種肉桂酚類物質(zhì)提取物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的糖消化酶抑制活性。值得注意的是，臺(tái)灣土肉桂較其他3個(gè)品種肉桂表現(xiàn)出更強(qiáng)的糖消化酶抑制活性。分析臺(tái)灣土肉桂的黃酮類物質(zhì)組成，不難發(fā)現(xiàn)其槲皮素-3-O-葡萄糖苷和蘆丁含量均顯著高于其他品種(P<0.05)，分別為(39.21±2.90)μg/g和(37.98±2.16)μg/g。酶抑制動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，槲皮素-3-O-葡萄糖苷和蘆丁通過混合競(jìng)爭抑制顯示出強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性[32]。Goncalves等[33]研究了多種酚類單體對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)蘆丁顯示出極強(qiáng)的抑制活性(IC50值為1.3 μmol/L)；Flores-bocanegra等[34]證明了槲皮素-3-O-葡萄糖苷對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶也具有較強(qiáng)的抑制活性。熒光淬滅光譜研究結(jié)果顯示，槲皮素-3-O-葡萄糖苷和蘆丁能與α-葡萄糖苷酶通過疏水相互作用和氫鍵驅(qū)動(dòng)形成強(qiáng)基態(tài)復(fù)合物，并導(dǎo)致酶的內(nèi)源熒光猝滅。槲皮素-3-O-葡萄糖苷和蘆丁強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性還與糖苷結(jié)構(gòu)取代C3-OH基團(tuán)有關(guān)。研究表明，糖苷結(jié)構(gòu)取代C3-OH基團(tuán)，導(dǎo)致了槲皮素-3-O-葡萄糖苷及蘆丁空間結(jié)構(gòu)增大，從而可能提高了其黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性[32]。因此，槲皮素-3-O-葡萄糖苷和蘆丁是臺(tái)灣土肉桂較其他3個(gè)品種肉桂表現(xiàn)出更強(qiáng)的糖消化酶抑制活性的主要原因之一。

表2 肉桂主要黃酮類成分含量

3 結(jié) 論

本研究表明，4個(gè)品種肉桂中游離態(tài)多酚和黃酮含量明顯高于結(jié)合態(tài)多酚和黃酮含量，且不同品種肉桂中酚類物質(zhì)含量存在顯著差異(P<0.05)，肉桂品種的不同可能是導(dǎo)致差異的主要原因之一。不同品種肉桂的抗氧化活性和糖消化酶抑制活性之間存在差異，其中臺(tái)灣土肉桂的抗氧化活性和糖消化酶抑制活性都明顯高于其他品種。相關(guān)性分析證明，肉桂多酚(黃酮)具有較強(qiáng)的糖消化酶抑制活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素-3-O-葡萄糖苷和蘆丁可能是臺(tái)灣土肉桂較其他3個(gè)品種肉桂表現(xiàn)出更強(qiáng)的糖消化酶抑制活性的主要原因之一。希望本研究結(jié)果可為肉桂品種選育、采收、加工和應(yīng)用提供理論依據(jù)。