抗阻運動促進大鼠導管相關性血栓溶解再通的研究

韋佳妮 趙慧函 蔣慶娟 文萃 黃欣欣 凌瑛 應燕萍

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（南寧 530021）

中心靜脈導管（central venous catheter，CVC）是經(jīng)外周靜脈置入頸內靜脈、鎖骨下靜脈或股靜脈等大中心靜脈且末端腔位于右心房內、上腔靜脈及下腔靜脈的血管留置裝置[1]。CVC 在全世界醫(yī)療衛(wèi)生機構的普遍使用導致許多導管相關并發(fā)癥出現(xiàn)，其中導管相關性血栓（catheter related thrombosis，CRT）是最常見且最嚴重的并發(fā)癥之一[2]。CRT 的發(fā)生可能會危及患者生命安全，導致患者就醫(yī)費用增加，加重社會醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)負擔。目前治療CRT 的方法主要包括抗凝、溶栓治療和導管處理?？鼓委焹H能防止血栓擴展，并不能加速其溶解，血凝塊仍需靠機體自身緩慢溶解；而溶栓治療的療效和安全性目前仍然存在爭議[3，4]。靜脈血栓的最終吸收和溶解主要依賴機體自身慢性自然溶解機制，因此，增加血栓的機化和血管新生有助于血栓的溶解吸收。此外，目前的指南均不推薦在發(fā)生血栓后常規(guī)拔除導管，并且如果患者治療仍需使用導管，拔管后另選部位重新置管后出現(xiàn)新發(fā)CRT的風險高達86%[5]。循證指南中指出置管側早期有效的上肢運動可以促進血液循環(huán)，降低CRT的發(fā)生率[6]。近些年有研究發(fā)現(xiàn)，運動可通過提高血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）表達及其活性水平來提高抗氧化能力[7]。而HO-1是血管內皮重要保護因子，通過介導復雜的炎癥反應及炎癥依賴性，在血管新生過程發(fā)揮重要作用[8]。此外，前期研究已表明運動預防CRT 形成[9，10]，但關于運動促進CRT 溶解再通的研究較少。因此，本研究通過建立大鼠CRT 模型，通過抗阻運動、注射HO-1激動劑鈷原卟啉（cobalt protoporphyrin，COPP）及抑制劑錫原卟啉（tin protoporphyrin IX，SnPP）干預，并進行相關指標檢測，為抗阻運動輔助治療CRT 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

7～8 周齡SPF 級雄性SD 大鼠144 只，體重200～220g，購于廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學動物實驗中心SPF 級動物房（SYXK 桂2020-0004）。飼養(yǎng)環(huán)境室溫20℃～25℃，濕度60%～70%，12 h 光/暗周期循環(huán)，通風、光線良好，大鼠自由進食、飲水。本實驗嚴格遵循實驗動物3R原則，并通過廣西醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審查（審批號：202008006）。

1.2 構建大鼠CRT模型

前期研究發(fā)現(xiàn)，置管7天后血栓高發(fā)，10天后血栓形成穩(wěn)定[11]。因此，本研究選用置管10 天后經(jīng)B 超確診血栓形成的大鼠CRT 模型，采用動物隨機分組軟件將大鼠隨機分為CRT 對照組（n=36）、CRT 抗阻運動組（n=36）、CRT+COPP 組（n=36）、CRT+SnPP 組（n=36）。大鼠CRT模型參照課題組前期實驗方法[12]，采用3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，待麻醉滿意后，右側頸部備皮，常規(guī)消毒、鋪巾，沿氣管右側0.5 cm 處縱切1～2 cm，逐層鈍性分離并游離右頸外靜脈，在結扎點下將靜脈剪一斜形切口，將導管送入至右心房上部，使用加入0.9%生理鹽水的注射器回抽血液，見回血后確認導管在靜脈血管中，并且血流通暢。用配套堵頭封閉導管末端，縫合傷口，常規(guī)消毒。大鼠麻醉復蘇后放回鼠籠，正常進食飲水。

1.3 干預方法

CRT+COPP 組和CRT+SnPP 組在置管10天后分別腹腔注射CoPP（c1900；Sigma）及SnPP（sentacruzBiotechnology）5mg／kg 進行干預，CRT 對照組不做干預。CRT+抗阻運動組運動方案參考前期研究方法[10]。所有大鼠術前1 周進行適應性訓練無負重預爬，每天能完成6次預爬的大鼠納入實驗，否則予剔除[13]。大鼠置管10 天后采用鼠尾捆綁負重砝碼的方式進行抗阻運動，爬梯高度1.1 m，階梯間隔2.0 cm，傾斜度為85°。大鼠從梯子底部開始往上爬到頂端，每周訓練6天，休息1天，1組/天，6次/組，2 min/次，每次到達梯子頂端休息20 秒，15 min 完成一次抗阻運動訓練，必要時刺激大鼠尾部促使其運動，總共訓練4 周?？棺柽\動過程中，砝碼的重量根據(jù)大鼠每周的體重調節(jié)，砝碼為標準砝碼，以達到負重準確量化。第1 周負重為大鼠自身體重的10%，第2周為30%，第3周為50%，至第4周負荷增加至體重的70%。

1.4 樣本采集

各組干預后的1、4、7、10、14、28 天，每個時間點隨機取6 只大鼠，待大鼠麻醉滿意后，進行腹主動脈采血，離心收集血清后放置于-80°冰箱，用于ELISA檢測血清HO-1、白介素（interleukin，IL）-6、IL-10 濃度。剪開大鼠置管側皮膚，逐層鈍性分離，取穿刺點至右心房上段約5 cm 靜脈血管，一部分用于病理切片HE 染色；另一部分用于qPCR 檢測。干預后的1、7、14、28天，取各組大鼠穿刺處至右心房約5 cm 靜脈血管，用于免疫組化CD31染色。

1.5 評價指標

1.5.1 血栓溶解再通情況

血管組織經(jīng)脫水包埋、切片，行蘇木精伊紅（H&E）染色，染色切片由數(shù)字病理切片掃描儀（NanoZoomer S60）采集圖像，應用Image-ProPlus圖像分析軟件進行分析，使用以下公式計算各組血栓溶解率：血栓溶解率=[（靜脈管腔面積-血栓面積）/靜脈管腔面積]×100%[14]。

1.5.2 ELISA檢測

大鼠腹主動脈采血后，室溫放置30 min，離心10 min，得到血清。使用ELISA 試劑盒檢測HO-1（ml003108）、IL-6（ml064292）、IL-10（ml002813）濃度，試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀（Synergy H1）檢測吸光度值，繪制標準曲線。

1.5.3 熒光定量PCR檢測

使用Trizol（Invitrogen，CA，USA）提取總RNA，逆轉錄為cDNA 后，用SYBR Green 法進行PCR 擴增，設置復孔，實驗結果重復3 次，使用2-△△Ct 法對qPCR 結果進行分析。以大鼠RPLP1 為內參，引物均由上海生物工程有限公司合成，引物序列為：

HO-1-F：5’-TCTGCAGGGGAGAATCTTGC-3’；

HO-1-R：5’-TTGGTGAGGGAAATGTGCCA-3；

RPLP1-F：5’-AAAGCAGCTGGTGTCAATGTT-3’；

RPLP1-R：5’-GCAGATGAGGCTTCCAATGT-3。

1.5.4 CD31免疫組化染色

血管組織石蠟包埋切片，使用0.1%檸檬酸鈉進行熱修復，自然恢復室溫后加入anti-CD31（AF6191，Affinity Biosciences），4°孵育過夜。使用通用二步法試劑盒（PV-9000，北京中杉金橋生物技術有限公司）滴加反應增強液、封閉、孵育二抗，DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）顯色，蘇木素復染。使用數(shù)字病理切片掃描儀采集圖像，應用Image pro plus圖像分析軟件分析，計算平均光密度值，分析血管新生情況。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 24.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理。結果以均數(shù)± 標準差（±s）表示。不同組別之間采用方差分析比較，若方差齊，則使用LSD 法進行兩兩比較；若方差不齊，則使用Tamhane T2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠基本情況及CRT病理形態(tài)

大鼠置管后存活率為100%，置管成功率為100%，導管留置期間無導管脫出，無出血、感染、肺栓塞等并發(fā)癥。干預1 天后可觀察到各組CRT 形成趨于穩(wěn)定，血栓膠原蛋白成分增多，并可見新生的肉芽組織由血管壁向血栓內生長，將纖維蛋白等血栓成分逐漸溶解、吸收，血栓開始機化。隨著時間推移，可見血栓體內部裂隙擴大，新生管腔樣結構形成，恢復部分再通。至28天后，CRT 對照組血栓內部形成新的血管相互吻合再通，被阻塞的血管部分重建血流，其中CRT+COPP組及CRT+抗阻運動組接近完全再通，CRT+SnPP 組中管腔內仍有紅細胞形成，僅部分再通（圖1）。

圖1 各組大鼠干預后不同時間點血管HE染色（n=6，50×）

2.2 各組大鼠不同時間點血栓溶解率比較

各組血栓溶解率隨時間延長而增加（表1）。其中，CRT+COPP組各時間點血栓溶解率均高于CRT對照組（P＜0.01），而CRT+SnPP組均低于CRT對照組（P＜0.05，P＜0.01）。CRT+抗阻運動組干預第28天血栓溶解率高于CRT對照組（P＜0.01），與CRT+COPP組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠干預后不同時間點血栓溶解率比較（n=6，%）

2.3 各組大鼠不同時間點血清HO-1、IL-6、IL-10 濃度比較

與CRT 對照組相比，CRT+COPP 組各時間點血清HO-1及IL-10含量上升、IL-6含量降低，CRT+SnPP組血清HO-1 及IL-10 含量降低、IL-6 含量上升，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；CRT+抗阻運動組第28天血清HO-1及IL-10升高，IL-6降低至與CRT對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而與CRT+COPP 組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠不同時間點血清HO-1（A）、IL-6（B）、IL-10（C）濃度比較（n=6）

2.4 各組大鼠不同時間點HO-1 mRNA表達比較

與CRT 對照組相比，CRT+COPP 組各時間點HO-1mRNA 表達均顯著增加（P＜0.01）；CRT+SnPP 組各時間點HO-1 mRNA 表達降低（P＜0.05）；CRT+抗阻運動組第28天HO-1表達量升高至與CRT對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而與CRT+COPP 組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖3）。

圖3 各組大鼠不同時間點HO-1 mRNA表達情況（n=6）

2.5 各組大鼠不同時間點CD31表達比較

免疫組化結果顯示，CD31 表達于血管內皮間隙。與CRT對照組比較，CRT+COPP組各時間點CD31表達顯著增加（P＜0.01）；CRT+SnPP 組中CD31 表達顯著減少（P＜0.01）。CRT+抗阻運動組第28天CD31表達顯著高于CRT 對照組（P＜0.01），與CRT+COPP 組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 各組大鼠干預后不同時間點免疫組化CD31染色（100×）（A）和各組大鼠干預后不同時間點平均光密度值（B）（n=6）

3 討論

正常情況下，HO-1在大多數(shù)細胞組織內呈低水平表達，但在多種氧化應激和炎癥信號誘導下高表達，并發(fā)揮抗炎和抗氧化作用[15]。IL-6 是一種炎癥反應因子，能夠促進炎癥反應；而IL-10作為一種抗炎因子，能夠抑制炎癥反應和促炎因子的釋放[16]。HO-1 被IL-6高度誘導，而HO-1 負調控IL-6，這表明HO-1 和IL-6之間存在負反饋循環(huán)；而IL-10 和HO-1 通過正反饋環(huán)相互聯(lián)系，IL-10 誘導可促進HO-1 高表達，從而可發(fā)揮其抗炎作用[17，18]。HO-1 具有保護血管的功能，可抑制血管中炎癥反應，保護血管內皮細胞使其免受氧化應激損傷[19]。有研究證實HO-1 在血栓溶解再通過程中扮演著重要角色，與未敲除HO-1基因小鼠相比，敲除HO-1 基因小鼠血栓機化再通過程明顯受到抑制[20]。Gabre 等[21]發(fā)現(xiàn)深靜脈血栓（deep venous thrombosis，DVT）形成小鼠，注射活化蛋白C 可通過HO-1 依賴的機制顯著加速血栓溶解。此外，HO-1 還可以誘導血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基質細胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）高表達，從而促進DVT溶解再通[22]。本研究顯示，COPP 和SnPP 能明顯影響HO-1 mRNA 的表達，同時，與CRT 對照組自然溶解過程相比，HO-1高表達的CRT+COPP組血栓溶解再通明顯加快，而抑制HO-1后，其血栓溶解再通速度明顯減慢，說明抗阻運動28 天后血栓溶解再通能起到與激動劑一樣的效果，由此證明抗阻運動28 天可上調HO-1 表達并促進CRT溶解再通。

運動應激通過自身調節(jié)及HO-1 代謝產(chǎn)物對HO-1系統(tǒng)產(chǎn)生影響，研究顯示運動誘導與HO-1的表達密切相關[23]。我們前期發(fā)現(xiàn)導管置入后改變血流的方向及速度，引起CRT 的發(fā)生，增加促炎細胞因子表達，導致HO-1 含量降低[24]。而抗阻運動可以改變血流切應力，發(fā)揮抗氧化保護作用，抑制炎癥反應，從而改善血管內皮的功能，減少CRT 形成[25]。前期研究發(fā)現(xiàn)CRT大鼠進行8 周抗阻運動后，HO-1 表達增加，修復氧化應激，從而改善血管內皮功能，在一定程度上預防CRT形成[10]。據(jù)報道，在健康志愿者中，HO 活性隨著運動的增加而增加，循環(huán)血液中的HO-1mRNA和蛋白表達升高[26]。動物研究同樣表明，運動可以增強心臟和血管平滑肌細胞中HO-1mRNA 的表達[27]。還有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)eCl3化學誘導小鼠動脈損傷后，運動通過促進內皮細胞生長、基質重塑和減少血管壁炎癥以及通過增加細胞外基質金屬蛋白酶活性來促進血栓消退和血管壁重塑[28]。本研究顯示，抗阻運動干預28天可上調HO-1并降低IL-6 水平，提高IL-10 水平，從而抑制炎癥反應，加速CRT 溶解再通。同時，CRT+抗阻運動組大鼠運動28 天后CRT 溶解率與對照組相比增加18.30%。由此推測，運動可上調HO-1表達，發(fā)揮抗炎作用，在一定程度上影響血栓溶解再通。

血栓溶解是一個復雜的過程，其過程與正常的傷口愈合過程大致相同，均伴隨炎癥細胞的浸潤及新生毛細血管的形成[29]。目前已證實新生血管對血栓溶解再通產(chǎn)生顯著影響，促進血管新生可以加速血栓的溶解再通。血栓機化初期，血栓從血管壁回縮，血栓主體和靜脈壁內膜之間形成內皮細胞內襯的口袋樣及裂縫結構，形成新的血管腔相互融合并擴大形成管道，逐漸恢復成血栓前狀態(tài)，使堵塞靜脈重新恢復血流[30]。如機體對血栓的吸收和溶解徹底，血管可完全再通，否則將出現(xiàn)血管狹窄或閉塞，引起血栓后綜合征（postthrombotic syndrome，PTS）的發(fā)生[31]。因此，促進血栓的早期溶解和吸收有助于血栓的治療，減少PTS 的發(fā)生。作為新生血管標志物，CD31存在于早期內皮細胞的邊緣，在血管內皮細胞的抗血栓/抗炎表型中起重要作用[32]。本研究通過免疫組織化學CD31染色發(fā)現(xiàn)，抗阻運動28 天誘導HO-1 表達可促進CRT 溶解再通，其機制可能與其促進新生血管形成有關。一項研究表明，HO-1 可促進內皮祖細胞增殖動員及遷移，并聚集至損傷區(qū)域向新生內皮細胞分化，從而促進血管修復及抗氧化應激損傷能力，這可能是HO-1促進血管新生的關鍵機制[33]。

綜上所述，抗阻運動、HO-1、抗炎、促血管新生、血栓溶解再通均存在相互關系?？棺柽\動作為一種生理刺激，可調節(jié)許多分子、信號通路，能明顯改善血管內皮功能，修復血管內皮損傷，減少血管炎癥。運動可能經(jīng)血流動力學刺激介導HO-1生物學活性，從而發(fā)揮血管保護作用。而HO-1 作為機體內源性保護因子能增強內皮細胞血管生成活性，促進新生血管形成，對多種血管源性損傷發(fā)揮保護作用。因此，本研究通過聚焦運動上調HO-1表達，從動物實驗層面表明抗阻運動加速CRT 溶解再通的安全性及有效性，并為臨床抗阻運動輔助治療CRT的實施提供有力證據(jù)及經(jīng)濟、科學、有效的輔助治療方案。

本研究也存在一定局限性，如未能運用B 超對大鼠CRT溶解再通過程進行監(jiān)測及從其他分子信號通路驗證血栓溶解再通機制，這些有待進一步深入研究。

4 總結

抗阻運動28天可誘導HO-1表達，發(fā)揮抗炎、促血管新生作用，最終加速CRT溶解再通。