蜂蜜中苦參堿與氧化苦參堿的快速檢測(cè)

荊輝華 向 俊，2 蔣登輝 馮燕英 王云昊 王亮亮

(1. 湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410017；2. 中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410083；3. 長(zhǎng)沙理工大學(xué)物理與電子科學(xué)學(xué)院柔性電子材料基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410114)

苦參堿和氧化苦參堿主要從豆科植物苦參中提取，因具有消炎、抗病毒、抗過(guò)敏、抗心律失常等作用，常被應(yīng)用于藥學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1-3]。在病蟲(chóng)防治方面，苦參堿和氧化苦參堿是一類(lèi)植物生物堿殺蟲(chóng)劑，具有觸殺、胃毒作用，對(duì)人畜低毒[4]。苦參堿在中國(guó)被允許用于柑橘、仁果類(lèi)水果以及瓜類(lèi)、蕓薹屬類(lèi)蔬菜，是一種新型的相對(duì)安全的生物農(nóng)藥，但近一年來(lái)，歐盟國(guó)家曾多次通報(bào)中國(guó)出口蜂蜜中檢出氧化苦參堿，產(chǎn)品被拒絕入境。根據(jù)歐盟(EC)第396/2005號(hào)規(guī)定，對(duì)于未經(jīng)批準(zhǔn)的物質(zhì)，其最大殘留限度一律設(shè)為10 μg/kg。據(jù)相關(guān)研究[5-7]顯示，苦參堿與氧化苦參堿是天然植物內(nèi)源性成分，在與苦參同屬豆科槐屬植物中廣泛存在，如中國(guó)西北地區(qū)廣泛分布的狼牙刺、西藏地區(qū)的砂生槐等蜜源植物均含有高含量的苦參堿與氧化苦參堿，因此部分蜂蜜中的苦參堿和氧化苦參堿可能是一種內(nèi)源性成分而非農(nóng)藥殘留。

目前，關(guān)于苦參堿和氧化苦參堿的檢測(cè)方法研究多集中于其作為含量較高的原料和藥物使用方面，如苦參作物[8-9]、中藥飲片[10]、復(fù)方苦參湯[11]、抗婦炎膠囊[12]等，主要有液相色譜法和液相色譜—質(zhì)譜法。在作為生物農(nóng)藥使用方面，可采用液相色譜串接質(zhì)譜儀測(cè)定有機(jī)茶葉、蔬菜、水果、魚(yú)肉及土壤中苦參堿和氧化苦參堿含量[13-16]，相比于液相色譜法，高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，更適用于蜂蜜中低含量的內(nèi)源性成分[17]、生物農(nóng)藥等目標(biāo)物的檢測(cè)。目前，關(guān)于蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿檢測(cè)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

研究擬采用液液萃取結(jié)合超高效液相—串聯(lián)質(zhì)譜法建立一種蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿含量的檢測(cè)方法，為蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)，為中國(guó)蜂蜜質(zhì)量安全提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、甲酸：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

氨水、乙酸銨、氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

無(wú)水硫酸鈉：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；

苦參堿(CAS號(hào)519-02-8，純度99.87%)、氧化苦參堿(CAS號(hào)16837-52-8，純度98.94%)標(biāo)準(zhǔn)品：北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；

蜂蜜：共45種，根據(jù)名稱(chēng)及蜜源進(jìn)行分類(lèi)，其中百花蜜13種，洋槐蜜11種，土蜂蜜8種，枇杷蜜3種，椴樹(shù)蜜2種，柑橘蜜2種，紫云英蜜2種，野菊花蜜2種，荊條蜜1種，山烏桕蜜1種，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：Waters Xevo TQ-S micro型，美國(guó)Waters公司；

電子分析天平：BSA224s型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

高速離心機(jī)：TG16-WS型，長(zhǎng)沙市湘儀儀器有限公司；

多管旋渦混合器：945066 數(shù)顯型，美國(guó)Talboys公司；

多通道平行濃縮儀：M64型，北京萊伯泰科儀器有限公司；

超純水機(jī)制備系統(tǒng)：Milli-Q型，美國(guó)Millipore公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理 蜂蜜攪拌均勻，取試樣1.00 g于15 mL 離心管中，加入3 mL超純水渦旋振蕩使蜂蜜充分溶解，加入6.0 mL 0.1%氨水—乙腈，加入無(wú)水硫酸鈉1.5 g，渦旋振蕩5 min，使0.1%氨水—乙腈與樣品溶液充分萃取，10 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取3.0 mL上清液氮吹至近干，90%乙腈/水溶液(含0.1%甲酸)定容至1.0 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測(cè)試。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

(1) 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的苦參堿和氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，分別配制成1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再準(zhǔn)確量取一定量的1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋成10 μg/mL的中間液，再將10 μg/mL的中間液稀釋成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，于4 ℃冷藏保存。

(2) 純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取一定體積的1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，用90%的乙腈/水溶液(含0.1%甲酸)定容，配制質(zhì)量濃度分別為1，5，10，20，50，80，100 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

(3) 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：用空白基質(zhì)蜂蜜樣品按前處理制得空白基質(zhì)溶液，采用空白基質(zhì)溶液配制成1，5，10，20，50，80，100 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式掃描；離子源溫度150 ℃；噴霧電壓2.0 kV；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；加熱氣溫度500 ℃；脫溶劑氣1 000 L/h；苦參堿、氧化苦參堿特征離子對(duì)及碰撞能量參數(shù)見(jiàn)表 1，選用信號(hào)較高的離子為定量離子對(duì)，苦參堿的定量離子對(duì)為249.2>148.2，定性離子對(duì)為249.2>110.2，氧化苦參堿的定量離子對(duì)為265.2>205.2，定性離子對(duì)為265.2>148.2。

表1 苦參堿和氧化苦參堿的質(zhì)譜參數(shù)?Table 1 Mass parameters for matrine and oxymatrine

1.3.4 色譜條件 Inspire HILIC色譜柱(150 mm×2.1 mm×3 μm)；流動(dòng)相A相為0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸銨溶液，B相為乙腈；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5.0 μL；梯度洗脫程序：0～2.0 min，10% A；2.0～3.0 min，10%～80% A；3.0～6.0 min，80% A；6.0～6.5 min，80%～10% A；6.5～10.0 min，10% A。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件 結(jié)果顯示，正離子模式(ESI+)下，合成了準(zhǔn)分子離子[M+H]+，苦參堿和氧化苦參堿的響應(yīng)靈敏度高，通過(guò)改變碰撞能量可觀察到信號(hào)較強(qiáng)的子離子，故采用MRM模式，對(duì)確定的子離子的碰撞能進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的質(zhì)譜參數(shù)。

2.1.2 色譜柱選擇 結(jié)果顯示C18柱中，需要較高比例的水相才能獲得一定的保留，然而較高比例的水相不利于樣品雜質(zhì)組分的分離和洗脫，同時(shí)高比例水相不利于目標(biāo)物蒸發(fā)電離，導(dǎo)致目標(biāo)物的ESI-MS靈敏度下降。HILIC色譜柱采用極性較強(qiáng)的固定相，提高了極性化合物的保留，采用HILIC色譜柱測(cè)定苦參堿和氧化苦參堿，獲得了滿意的保留效果，且目標(biāo)物峰型較好，因此選擇HILIC柱為分離色譜柱。

2.1.3 色譜條件 結(jié)果顯示，在0.1%甲酸中，目標(biāo)物峰嚴(yán)重拖尾，且響應(yīng)信號(hào)低。在0.1%甲酸中加入5 mmol/L的乙酸銨，峰型可得到明顯改善，且響應(yīng)信號(hào)增強(qiáng)，可能由于生物堿測(cè)定中堿基與色譜柱中陰離子硅醇官能團(tuán)相互作用導(dǎo)致的拖尾效應(yīng)[14]，加入緩沖鹽可降低其相互作用，明顯改善目標(biāo)化合物峰型。故采用0.1%甲酸—5 mmol/L 乙酸銨緩沖液和乙腈進(jìn)行梯度洗脫，并在10 min 內(nèi)完成單個(gè)樣品的分析測(cè)試，采用優(yōu)化好的色譜條件，樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物檢測(cè)干擾小，峰型良好，標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性樣品及陰性樣品的MRM圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液、不同樣品的MRM色譜圖Figure 1 MRM chromatograms of the standard solution and different sample solution

2.2 提取條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑和鹽析劑 液液萃取中，常用的萃取溶劑有正己烷、乙酸乙酯、乙腈等，正己烷和乙酸乙酯的極性較弱，對(duì)極性化合物的提取效果較差，乙腈對(duì)極性或非極性化合物的提取率較高，乙腈雖能與水互溶，但在水相體系中加入適量鹽就能促使乙腈與水分離，使得目標(biāo)物被富集于乙腈層中。根據(jù)苦參堿和氧化苦參堿易溶于極性溶劑的性質(zhì)，選用乙腈體系作為萃取溶劑。

蜂蜜中含果糖和葡萄糖，在一定濃度下，其本身也能促使乙腈和水分離[18]，因此，蜂蜜水—乙腈體系在不加鹽的情況下也能相分離?？疾鞜o(wú)鹽、NaCl、Na2SO4、MgSO4、QuEChERS試劑(4 g無(wú)水 MgSO4、1 g NaCl、0.5 g 檸檬酸氫二鈉和1 g檸檬酸鈉)對(duì)回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。若直接采用乙腈萃取，苦參堿和氧化苦參堿的回收率較低，由表2可知，除加入QuEChERS鹽析劑后目標(biāo)物的回收率分別為56.7%，54.4%外，其他幾種鹽析劑的回收率未超過(guò)50%。采用酸性乙腈提取時(shí)，加入MgSO4的回收率最高，其中苦參堿和氧化苦參堿的回收率分別為78.3%，76.0%。采用堿性乙腈提取時(shí)，苦參堿的回收率明顯升高，未加鹽和不同鹽析劑下的回收率均>80%，其中Na2SO4的回收率最高達(dá)99.1%。鹽析劑種類(lèi)對(duì)苦參堿的影響較小，但對(duì)氧化苦參堿的影響較大。不加鹽情況下氧化苦參堿回收率為35.9%，加入NaCl后回收率降低，可能是NaCl抑制氧化苦參堿從水相中轉(zhuǎn)移至乙腈中，其他幾種鹽的回收率依次為Na2SO4>MgSO4>QuEChERS，Na2SO4的回收率達(dá)83.0%?？鄥A和氧化苦參堿為堿性化合物，萃取溶劑中加入堿能促使目標(biāo)物化合物以分子形式存在，增加其在乙腈中的溶解度，從而提高回收率。比較0.1%，0.2%，0.5%，1.0%，2.0%氨水—乙腈對(duì)目標(biāo)物提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)氨水濃度對(duì)回收率無(wú)顯著影響，綜合考慮，以0.1%氨水—乙腈作為萃取溶劑，并采用Na2SO4作為鹽析劑。

表2 不同萃取體系及鹽種類(lèi)的回收率Table 2 Recoveries of different extraction systems and salt species %

2.2.2 蜂蜜質(zhì)量與加水量 蜂蜜含糖量一般為60%～80%，黏稠度較大。如直接用有機(jī)試劑提取，提取樣品易呈現(xiàn)膠質(zhì)狀，目標(biāo)物可能會(huì)被蜂蜜中糖分吸附，進(jìn)而導(dǎo)致提取效果較差[19]，故先用適量水溶解蜂蜜，使其成為均相體系。為保證試驗(yàn)參數(shù)一致，增加水量同時(shí)增加溶劑用量。由圖2可知，加水稀釋影響目標(biāo)物的提取，其中對(duì)氧化苦參堿的影響大于苦參堿，當(dāng)m蜂蜜∶V水<1∶3 (g/mL)時(shí)，樣品中氧化苦參堿的回收率較低，繼續(xù)加大水量，二者回收率均降低。加水量過(guò)多，目標(biāo)物在水中溶解量增加難以萃取完全。因此，采用1 g蜂蜜加3 mL水進(jìn)行溶解。

圖2 蜂蜜質(zhì)量與加水體積比例對(duì)回收率的影響Figure 2 Recoveries of different proportions of honey mass and water volume

2.2.3 萃取溶劑用量 由圖3可知，隨著萃取溶劑用量的提高，回收率增加，當(dāng)萃取溶劑用量為6 mL時(shí)，回收率無(wú)明顯增加，且溶劑用量繼續(xù)提高會(huì)增加糖在萃取劑乙腈中溶解，故采用6 mL 0.1%氨水—乙腈進(jìn)行萃取。

圖3 萃取劑用量對(duì)回收率的影響Figure 3 Recoveries of different amounts of extraction solvent

2.2.4 鹽析劑用量 由圖4可知，隨著Na2SO4用量的增加，回收率提高，當(dāng)Na2SO4加入量>1.5 g時(shí)，二者回收率無(wú)明顯增加，故鹽析劑用量選1.5 g。

圖4 鹽析劑用量對(duì)回收率的影響Figure 4 Recoveries of different amounts of salting-out agent

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率評(píng)估[20]，基質(zhì)效應(yīng)<100%表明存在基質(zhì)抑制，基質(zhì)效應(yīng)>100%表明存在基質(zhì)增強(qiáng)，基質(zhì)效應(yīng)為80%～120%，通常認(rèn)定基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量檢測(cè)的影響可被接受。由表3可知，苦參堿和氧化苦參堿的基質(zhì)效應(yīng)分別為91.5%，89.9%，均存在一定的基質(zhì)抑制，但處于可被接受的范圍內(nèi)，常規(guī)檢測(cè)可采用溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量分析。同時(shí)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相的組成和比例對(duì)基質(zhì)效應(yīng)有影響，適當(dāng)提高溶劑極性，如適當(dāng)提高流動(dòng)相中水相比例能一定程度降低基質(zhì)干擾，后續(xù)可考慮優(yōu)化流動(dòng)相比例降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。這可能由于樣品中某些極性化合物與目標(biāo)物出峰時(shí)間相近，干擾目標(biāo)物電離，適當(dāng)提高水相比例，有助于雜質(zhì)與目標(biāo)物的分離，降低了其對(duì)樣品分析的干擾。

表3 蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿的基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Matrix effects of matrine and oxymatrine in honey

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限 由表4可知，苦參堿和氧化苦參堿的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999以上，符合定量要求，定量限為0.3 μg/kg。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 4 Linear equations, correlation coefficients (R2) and LODs and LOQs of analytes

2.4.2 回收率和精密度 由表5可知，苦參堿的加標(biāo)回收率為90.9%～95.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.98%～6.78%，氧化苦參堿的回收率為80.9%～84.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.45%～5.06%，平均回收率和RSD均符合GB/T 27404—2008附錄F的要求，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好。

表5 陰性蜂蜜樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 Spiked recoveries and RSD of analytes in blank honey (n=6)

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用試驗(yàn)建立的定性和定量分析方法對(duì)收集到的45批次蜂蜜進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，同一樣品中一般苦參堿和氧化苦參堿同時(shí)檢出，土蜂蜜和百花蜂蜜雖有檢出，但含量較低，其中洋槐蜜11份，檢出7份，檢出率為63.6%，且檢出樣品的含量相對(duì)較高，苦參堿含量最高達(dá)58.40 μg/kg，氧化苦參堿含量最高達(dá)93.17 μg/kg，考慮內(nèi)源性成分可能性大，因?yàn)槔茄来?、砂生槐?lèi)植物中含苦參堿和氧化苦參堿[6-7]，洋槐與這兩類(lèi)植物同屬豆科植物，花期和地理分布相近，洋槐蜜源容易遭受狼牙刺、砂生槐蜜源的影響，導(dǎo)致洋槐蜜中檢出苦參堿和氧化苦參堿。

3 結(jié)論

建立了液液萃取結(jié)合UPLC-MS/MS檢測(cè)蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿的分析方法。結(jié)果表明，該方法前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，回收率穩(wěn)定，將該方法用于市售蜂蜜的測(cè)定，成功檢測(cè)出蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿含量，方法可靠性高，快速準(zhǔn)確，適用于蜂蜜樣品的批量檢測(cè)，可以成為蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿殘留的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)。如何進(jìn)一步提高氧化苦參堿的回收率是值得研究的問(wèn)題，同時(shí)，后期將增加樣本的種類(lèi)和數(shù)量，系統(tǒng)地研究苦參堿、氧化苦參堿與蜜源的關(guān)系，為蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供更為充分的依據(jù)。

表6 蜂蜜樣品中苦參堿和氧化苦參堿含量分布?Table 6 Distribution of matrine and oxymatrine contents in different honey samples