一例豬細(xì)小病毒2型和3型混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

拉馬甲甲，張 陽，徐志文*

（1.四川省喜德縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 喜德 616750；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物疾病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130）

豬細(xì)小病毒?。≒PI）會(huì)導(dǎo)致豬只繁殖功能障礙、消化和呼吸系統(tǒng)疾病，是由豬細(xì)小病毒（PPV）感染引起的。目前，細(xì)小病毒分為經(jīng)典的豬細(xì)小病毒1 型（PPV1）以及近幾年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的2～7 型（PPV2～7）等新型細(xì)小病毒［1］。其中，PPV1、PPV2 和PPV3 在我國廣泛分布，且常與其他病原混合感染，對(duì)我國養(yǎng)殖業(yè)危害極大。豬細(xì)小病毒感染常發(fā)于初產(chǎn)母豬，表現(xiàn)為流產(chǎn)、木乃伊胎以及病弱胎，而母豬本身并無明顯癥狀［2］。仔豬感染后可導(dǎo)致生長受阻，同時(shí)還會(huì)造成炎癥疾?。?］。豬細(xì)小病毒具有很強(qiáng)的傳染性，既可通過生育垂直傳播，也可通過口鼻水平傳播，一旦病毒傳入，幾個(gè)月內(nèi)便可感染所有健康豬群，而感染后的豬可長時(shí)間帶毒排毒，難于控制，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的正常發(fā)展。

四川省涼山州某規(guī)?；i場(chǎng)的初產(chǎn)母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)弱仔和死胎的情況，據(jù)了解，該場(chǎng)曾有過細(xì)小病毒、圓環(huán)病毒2 型和藍(lán)耳病發(fā)病史。為探明發(fā)病原因，本試驗(yàn)采集了病死豬病料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。

1 材料與方法

1.1 病料來源 病料采集于四川省涼山州某規(guī)?；i場(chǎng)死胎仔豬的心包積液、新鮮肺臟、肝臟及淋巴結(jié)。

1.2 試劑 TSA 培養(yǎng)基，DL2000 DNA Marker，ddH2O，Trizol 細(xì)胞裂解液，PrimeScriptTMRT Reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，2×Taq MasterMix，通用型基因組DNA提取試劑盒。

1.3 細(xì)菌學(xué)檢測(cè) 在超凈臺(tái)內(nèi)用接種環(huán)無菌蘸取死胎仔豬的心包積液、肝臟組織病料接種于TSA 培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天觀察菌落生長情況。

1.4 病毒檢測(cè)

1.4.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank 已登錄的PRRSV、PCV2、PPV1、PPV2、PPV3 的基因序列，利用Oligo 7 軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。

表1 引物信息

1.4.2 病料DNA/RNA的抽提及RNA的反轉(zhuǎn)錄 剖解仔豬，取淋巴結(jié)、肝臟、肺臟，加適量PBS 和鋼珠于EP 管中，放入冷凍型組織研磨器，于60 Hz 4 ℃研磨10 min，反復(fù)凍融3 次后離心取上清液（12 000 r/min，10 min）。利用通用型基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行病料DNA的抽提。采用Trizol法進(jìn)行病料RNA的抽提。抽提完的病料RNA使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得病料的cDNA。

1.4.3 PCR 擴(kuò)增檢測(cè) 50 μL 反應(yīng)體系：2×Taq MasterMix 25 μL，上、下游引物各2 μL；DNA/cDNA 各1 μL，RNase-Free H2O 20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌學(xué)檢查 經(jīng)過37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 的平板無菌落生長，表明無細(xì)菌感染。

2.2 病毒檢測(cè) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，PPV2和PPV3分別擴(kuò)增出500 bp左右（見圖1）和200 bp 左右（見圖2）的目的條帶，與預(yù)期片段大小相符，而PCV2（見圖3）、PPV1（見圖4）和PRRSV（見圖5）并未擴(kuò)增出任何條帶。陰性和陽性對(duì)照均成立。結(jié)合發(fā)病情況及PCR檢測(cè)結(jié)果，判斷該病例為PPV2和PPV3的混合感染。

圖1 PPV2 PCR檢測(cè)結(jié)果

圖2 PPV3 PCR檢測(cè)結(jié)果

圖3 PCV2 PCR檢測(cè)結(jié)果

圖4 PPV1 PCR檢測(cè)結(jié)果

圖5 PRRSV RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

細(xì)小病毒在自然界中普遍存在，侵染宿主范圍廣泛，涉及脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物及人類。目前為止，能感染豬的細(xì)小病毒共有7 種，即豬細(xì)小病毒1～7 型。其中，PPV1 造成的危害最為嚴(yán)重，是豬場(chǎng)管理中重點(diǎn)防范的病原之一，而其余分型卻較少關(guān)注。有文獻(xiàn)指出，PPV2 和PPV3 在我國的流行程度不亞于PPV1，這提示我們廣泛的PPV2 和PPV3 感染可能會(huì)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成潛在的危害［4］。

豬細(xì)小病毒于世界各地分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大損失。目前尚無針對(duì)豬細(xì)小病毒的特效抗病毒藥物，對(duì)豬細(xì)小病毒的控制也主要以預(yù)防為主。便捷、靈敏、特異的檢測(cè)方法能幫助豬場(chǎng)更好地控制豬細(xì)小病毒的傳播。PCR 技術(shù)自提出已經(jīng)過幾十年快速發(fā)展，并衍生出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR、原位PCR、RT-RAA 等技術(shù)。但傳統(tǒng)的PCR 技術(shù)仍是目前獸醫(yī)診斷的基礎(chǔ)技術(shù)，并廣泛用于各種疾病的基礎(chǔ)診斷。針對(duì)不同疾病設(shè)計(jì)出特異性引物，結(jié)合自動(dòng)核酸提取儀，可在2 h內(nèi)完成全部檢測(cè)，且具有較高的特異性和靈敏性。

本案例中，我們首先了解到該豬場(chǎng)的發(fā)病情況主要為母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎，并且該場(chǎng)曾有過細(xì)小病毒、藍(lán)耳病毒和圓環(huán)病毒發(fā)病史，于是我們推斷此次發(fā)病可能是該豬場(chǎng)消毒未到位而導(dǎo)致的病毒感染。通過細(xì)菌檢測(cè)，結(jié)果也證實(shí)了并不是細(xì)菌導(dǎo)致的流產(chǎn)。PCR結(jié)果顯示，該豬場(chǎng)發(fā)病為PPV2 及PPV3 混合感染導(dǎo)致的。豬細(xì)小病毒主要引起母豬的繁殖障礙多發(fā)于8～10 月，患病母豬多無臨床癥狀，難以提前治療。有研究指出，PPV2 常與PCV2 混合感染，導(dǎo)致豬只出現(xiàn)豬呼吸道病復(fù)合體，最后因肺炎而死亡［5］。制定科學(xué)的免疫計(jì)劃，做好定期消毒工作，減少病毒的繼發(fā)感染，阻斷病原微生物的感染與傳播，是保障豬場(chǎng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的根本措施。■