老年子宮內(nèi)膜癌患者組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3表達(dá)及意義

梁秀蘭 邱紅兵 鄭玉丹

(邢臺(tái)市人民醫(yī)院婦三科第三病區(qū)，河北 邢臺(tái) 054000)

70%～75%的子宮內(nèi)膜癌發(fā)生于絕經(jīng)后女性，高發(fā)年齡為70～79歲〔1〕。臨床研究認(rèn)為年齡是子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素，高齡子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后差〔2〕；老年子宮內(nèi)膜癌患者與中年患者相比，在組織浸潤(rùn)、病理類型、相關(guān)標(biāo)志物水平、腫瘤復(fù)發(fā)率等方面存在一定差異〔3〕。目前子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，其發(fā)生與進(jìn)展涉及血管生成、細(xì)胞增殖與凋亡、免疫炎癥反應(yīng)等多個(gè)方面，受多種因素影響〔4〕。近年來(lái)隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，基因檢測(cè)逐漸用于惡性腫瘤的診斷、病情評(píng)估、預(yù)測(cè)預(yù)后水平，具有較高的臨床參考價(jià)值〔5〕。本研究旨在探討老年子宮內(nèi)膜癌患者組織中環(huán)氧合酶2、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)3表達(dá)特點(diǎn)及對(duì)病情發(fā)展和預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1病例資料 選取2015年1～12月邢臺(tái)市人民醫(yī)院收治的老年子宮內(nèi)膜癌患者160例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥60歲，住院手術(shù)治療或在門診行病理活檢；②組織病理學(xué)檢查確診為子宮內(nèi)膜癌；③能夠正常溝通，完成隨訪，研究資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他類型惡性腫瘤；②采集標(biāo)本前有放化療、激素治療史者。年齡60～79歲，平均(71.83±4.59)歲。收集同期在本院因子宮良性腫瘤切除子宮的老年患者80例，年齡60～77歲，平均(71.17±5.20)歲。年齡在子宮內(nèi)膜癌與子宮良性腫瘤患者間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2主要試劑與儀器 兔抗人環(huán)氧合酶2單克隆抗體、鼠抗人NF-κB單克隆抗體、鼠抗人STAT3單克隆抗體購(gòu)于北京博奧森生物有限公司；PV9000二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海齊一生物有限公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司。LS-2065石蠟切片機(jī)購(gòu)于深圳達(dá)科為生物股份有限公司；IX73倒置顯微鏡購(gòu)于日本奧林巴斯株式會(huì)社。

1.3免疫組化檢測(cè)環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3陽(yáng)性表達(dá)情況 使用10%多聚甲醛固定子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。PV9000二步法行免疫組化檢測(cè)，加入兔抗人環(huán)氧合酶2單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人NF-κB單克隆抗體(1∶800稀釋)、鼠抗人STAT3單克隆抗體(1∶800稀釋)，操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。光學(xué)顯微鏡高倍鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野拍照，進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)染色細(xì)胞數(shù)量和染色強(qiáng)度評(píng)分進(jìn)行評(píng)價(jià)；染色細(xì)胞數(shù)量評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞比例<25%計(jì)1分、25%～50%計(jì)2分、51%～75%計(jì)3分、>75%計(jì)4分；染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色計(jì)0分、淺黃色計(jì)1分、黃色計(jì)2分、棕黃色計(jì)3分；二者乘積≤2分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.4RT-PCR檢測(cè)環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA表達(dá) 總RNA提取試劑盒收集子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR擴(kuò)增引物由上海達(dá)為科生物有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列為環(huán)氧合酶2上游：5′-GAAGTCCCCTCTTTAACCGAG-3′，下游：5′-CTTTAGACGGGT-CGTGATGCCA-3′。NF-κB上游：5′-ACGTCATTAGGCGGTCGGAA-3′，下游：5′-CTCATGTAGTAGGTC-GTCGTG-3′。STAT3上游：5′-GCAACGTAGGCTG-GAGTGGA-3′，下游：5′-AGTCTCGTTACGTAGGAC-GTT-3′。β-actin上游：5′-GGTAGTGTTACGGACACCATGCTG-3′，下游引物：5′-G GTGGTACATGGGTCCGTAACG-3′。反應(yīng)體系20 μl，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性1 min，50℃復(fù)性50 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸2 min。以參照基因β-actin為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對(duì)定量。

1.5Western印跡檢測(cè)環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA蛋白表達(dá) 放射免疫沉淀(RIPA)裂解液提取子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織的總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，使用脫脂奶粉封閉液室溫下封閉1 h，滴加兔抗人環(huán)氧合酶2單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人NF-κB單克隆抗體(1∶800稀釋)、鼠抗人STAT3單克隆抗體(1∶800稀釋)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃孵培育過(guò)夜。滴加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，1∶2 000稀釋，室溫靜置1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，使用Image J軟件讀取各條帶的灰度值。

1.6隨訪及資料收集 對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者進(jìn)行為期5年的隨訪，采取電話結(jié)合定期門診復(fù)查的形式，記錄生存情況。入組時(shí)收集子宮內(nèi)膜癌患者的分化程度、國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、肌層浸潤(rùn)情況。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及單因素和多因素Cox回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1不同組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3表達(dá)情況 環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中，陽(yáng)性表達(dá)呈黃色或棕黃色顆粒。子宮內(nèi)膜癌組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(均P<0.001)。見(jiàn)圖1，表1。

2.2不同組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 子宮內(nèi)膜癌組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(均P<0.001)。見(jiàn)表2。

圖1 不同組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3蛋白表達(dá)(免疫組化染色，×200)

表1 不同組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3陽(yáng)性表達(dá)水平比較〔n(%)〕

2.3老年子宮內(nèi)膜癌患者環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3表達(dá)水平在不同分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)的老年子宮內(nèi)膜癌患者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中中低分化、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)≥1/2的環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3表達(dá)水平明顯偏高。見(jiàn)表3。

2.4不同環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3表達(dá)情況患者生存時(shí)間比較 環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3陽(yáng)性表達(dá)者生存時(shí)間〔(26.84±4.97)、(28.05±4.36)、(25.69±5.24)個(gè)月〕短于陰性表達(dá)者〔(47.52±3.04)、(48.81±3.59)、(50.37±2.71)個(gè)月〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.189、27.053、30.697，均P=0.000)。

2.5老年子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析 單因素Cox回歸分析顯示，分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)、環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3是老年子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表2 不同組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

表3 老年子宮內(nèi)膜癌患者環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系〔n(%)〕

表4 老年子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析

2.6老年子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析 將單因素分析中分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)、環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3進(jìn)一步納入多因素Cox回歸分析模型，結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)、環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3是老年子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 老年子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的Cox多因素分析

3 討 論

環(huán)氧合酶2是前列腺合成中的關(guān)鍵酶，可通過(guò)調(diào)節(jié)前列腺素的合成來(lái)影響機(jī)體的病理生理過(guò)程〔6〕。環(huán)氧合酶2基因?qū)儆谡T導(dǎo)表達(dá)蛋白，正常生理狀態(tài)下人體組織細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)，當(dāng)受到刺激后出現(xiàn)誘導(dǎo)性表達(dá)〔7〕。本研究結(jié)果提示環(huán)氧合酶2參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與發(fā)展，其過(guò)表達(dá)促進(jìn)腫瘤發(fā)展的可能原因?yàn)?，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞凋亡，誘發(fā)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制并刺激新生血管形成〔8〕。NF-κB是人體細(xì)胞中的重要轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)機(jī)體免疫、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等過(guò)程，具有多種功能〔9〕。相關(guān)研究顯示，NF-κB能夠誘發(fā)腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程，在肝細(xì)胞癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織中均存在NF-κB持續(xù)激活〔10，11〕。目前研究認(rèn)為NF-κB引發(fā)腫瘤的機(jī)制包括：①通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期素D1的調(diào)控來(lái)誘發(fā)細(xì)胞不受控制的無(wú)限增殖〔12〕；②通過(guò)激活凋亡抑制基因，合成抗凋亡因子，激活原癌基因等機(jī)制來(lái)抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，減慢細(xì)胞凋亡速率〔13〕。本研究結(jié)果提示NF-κB參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與進(jìn)展，在其中發(fā)揮重要作用。

STAT3是近年來(lái)被廣泛研究的轉(zhuǎn)錄因子，參與機(jī)體正常細(xì)胞的增殖、分化和新生血管生成和調(diào)控免疫活動(dòng)〔14〕。當(dāng)STAT3異常活化后能夠介導(dǎo)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和凋亡等過(guò)程，在腫瘤新生血管形成、免疫逃逸等過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔15〕。相關(guān)研究顯示，膠質(zhì)瘤組織中STAT3表達(dá)水平明顯高于正常腦組織，其在高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織〔16〕。本研究結(jié)果提示STAT3能夠作為一項(xiàng)反映子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為的重要指標(biāo)，用于臨床診斷和預(yù)后評(píng)估。對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者進(jìn)行為期5年的隨訪，結(jié)果顯示，環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的參考指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲性與子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后生存時(shí)間明顯相關(guān)〔17〕，本研究中FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)能夠間接反映出子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移和侵襲能力，影響患者生存時(shí)間。

綜上，環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3陽(yáng)性的子宮內(nèi)膜癌患者生存時(shí)間較短，可能與腫瘤分化程度較低、分期較高、肌層浸潤(rùn)程度高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例高有關(guān)，可作為子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤侵襲性和預(yù)后評(píng)估的參考指標(biāo)。