宋晉 梁婷 王強 陳繪景
(1武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北 武漢 430065;2武漢市精神衛(wèi)生中心)
癲癇是一種慢性大腦短暫性功能障礙,患者反復(fù)發(fā)作會出現(xiàn)抑郁、焦慮等精神問題,嚴(yán)重影響患者身心健康及生活質(zhì)量〔1,2〕。目前癲癇治療仍以藥物為主,但仍有20%~30%癲癇患者經(jīng)藥物治療無效,因此探索安全、無創(chuàng)的有效抗癲癇手段至關(guān)重要。低頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(rTMS)是一種新型無痛、無創(chuàng)性抗癲癇技術(shù),可降低癲癇患者發(fā)作頻率、減輕抑郁樣行為〔3~5〕,但其具體作用機制尚不完全明確。研究發(fā)現(xiàn),異常突出形成可能與癲癇發(fā)生發(fā)展有關(guān),位于突觸后成分中的樹突棘形成和降解動態(tài)變化是突觸可塑性的標(biāo)志,而微小RNA(miR)-134與樹突棘的發(fā)育有關(guān),對神經(jīng)可塑性起重要作用,可參與癲癇及腦神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展〔6,7〕。環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)是神經(jīng)可塑性重要調(diào)節(jié)因子,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是CREB經(jīng)典下游靶基因,對多種神經(jīng)元具有營養(yǎng)、成熟等作用,可促進(jìn)神經(jīng)元的可塑性及神經(jīng)遞質(zhì)的形成,與抑郁、焦慮樣行為及認(rèn)知障礙等密切相關(guān)〔8~10〕,但關(guān)于rTMS抗癲癇作用是否與調(diào)節(jié)miR-134/CREB/BDNF通路有關(guān)鮮有研究。本研究擬探究rTMS對癲癇大鼠抑郁、焦慮樣行為及miR-134/CREB/BDNF通路的影響,以期揭示其作用機制。
1.1實驗動物 健康成年雄性清潔級SD大鼠36只,體重280~300 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。于本院實驗動物房環(huán)境溫度(23±2)℃、濕度(60±5)%,12 h晝夜節(jié)律控制條件下飼養(yǎng),自由飲水、采食。
1.2主要試劑及儀器 氯化鋰(貨號:L4408,純度≥99.0%)購自Sigma-Aldrich公司;硫酸阿托品(國藥準(zhǔn)字H20073819)購自河南普瑞制藥有限公司;毛果蕓香堿(貨號:92-13-7)購自湖北諾納科技有限公司;Trizol試劑(貨號:R0016)、蛋白抽提試劑盒(貨號:P0028)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(貨號:P0010S)均購自上海碧云天公司;miR定量試劑盒(貨號:638315)、PrimeScriptTMRT reagent Kit(貨號:RR037A)、TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ(貨號:RR820A)均購自TaKaRa公司;引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成;兔源一抗anti-CREB(貨號:ab31387)、anti-p-CREB(貨號:ab220798)、anti-BDNF(貨號:ab108319)、anti-β-actin(貨號:ab-179467)、二抗羊抗兔IgG(貨號:ab6721)均購自英國Abcam公司;Evolution 220紫外分光光度計、MODEL550型酶標(biāo)儀均購自美國Thermo公司;7500熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)儀購自美國Bio-Rad公司等。
1.3方法
1.3.1分組及癲癇大鼠模型制備 36只大鼠隨機分為正常對照組(NC組)、假刺激組(s-rTMS組)及rTMS組,每組12只。NC組為正常飼養(yǎng)未進(jìn)行任何刺激正常大鼠;rTMS組大鼠行rTMS刺激,刺激參數(shù):0.75 Hz,75%閾強度,20次/串,5串/d;s-rTMS組給予次數(shù)相同、聲音相似的假性刺激,均連續(xù)7 d。7 d后s-rTMS組及rTMS組腹腔注射氯化鋰127 mg/kg,16~20 h后注射毛果蕓香堿35 mg/kg,注射毛果蕓香堿前30 min注射阿托品1 mg/kg,根據(jù)Racine分級〔11〕(0級:無任何反應(yīng);Ⅰ級:面部陣攣,包括眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼等;Ⅱ級:Ⅰ級反應(yīng)+節(jié)律性點頭;Ⅲ級:Ⅱ級反應(yīng)+前肢陣攣;Ⅳ級:Ⅲ級反應(yīng)+后肢站立;Ⅴ級:Ⅳ級反應(yīng)+摔倒)觀察大鼠癲癇發(fā)作程度,連續(xù)3次達(dá)到Ⅳ~Ⅴ級發(fā)作即被認(rèn)為癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)即造模成功,SE點燃1 h后腹腔注射地西泮10 mg/kg終止發(fā)作。NC組大鼠腹腔注射等量生理鹽水代替毛果蕓香堿,其余處理同s-rTMS組及rTMS組。
1.3.2抑郁樣行為學(xué)檢測 采用強迫游泳實驗及曠場實驗檢測大鼠抑郁樣行為。(1)強迫游泳實驗:準(zhǔn)備圓柱形透明玻璃容器,直徑20 cm,高50 cm,水溫23~25 ℃,水深35 cm,使得大鼠在其中不能靠四肢或尾巴支撐桶底而把頭露出水面呼吸。實驗前1 d進(jìn)行15 min適應(yīng)性訓(xùn)練。實驗時將大鼠置于容器內(nèi),記錄其在5 min內(nèi)累積不動時間,其中“不動”標(biāo)準(zhǔn)為:漂浮在水中不掙扎或僅保持頭部在水面以上或接觸水池底部超過1 s。(2)曠場實驗:將大鼠放入80 cm×80 cm×40 cm的黑色敞箱中,箱底均勻劃分5 cm×5 cm小格,每次從同一方向放入,記錄大鼠5 min內(nèi)水平站立次數(shù)及垂直站立次數(shù)。
1.3.3焦慮樣行為學(xué)檢測 分別采用高架十字迷宮實驗及新穎環(huán)境抑制攝食測試檢測大鼠焦慮樣行為。(1)高架十字迷宮實驗:將大鼠置于標(biāo)準(zhǔn)高架迷宮正中央,頭超封閉壁,使大鼠自由探索5 min,記錄大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)(OE)、封閉臂次數(shù)(CE)及封閉臂停留時間(CT)、開放臂停留時間(OT),計算總穿臂次數(shù)(TE):OE+CE;進(jìn)入開放臂次數(shù)的比例(OE%):OE/(OE+CE)× 100%;開放臂停留時間比例(OT%):OT/(OT+CT)×100%。(2)新穎環(huán)境抑制攝食測試:利用大鼠喜歡趨邊特性,檢測焦慮樣行為。大鼠禁食24 h后,保持實驗環(huán)境安靜,然后將大鼠放入頂部開放、底部劃分為大小均勻的15 cm× 15 cm方格木質(zhì)箱子的角落,中間擺放一顆食物,攝像頭記錄10 min內(nèi)大鼠從放進(jìn)盒子里到準(zhǔn)備進(jìn)食的攝食潛伏期,以此作為評價焦慮樣行為的指標(biāo)。
1.3.4海馬miR-134、CREB及BDNF mRNA相對表達(dá)量檢測 各組大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛1 ml/kg麻醉處死后斷頭取腦,分離海馬組織。采用Trizol試劑提取總RNA,濃度和純度檢測合格后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,置于-80℃中保存?zhèn)溆谩2捎肦T-qPCR擴增miR-134、CREB及BDNF mRNA片段。引物序列:miR-134:上游:5′-GGGTGTGACTGGTTGAC-3′,下游:5′-CACAGCTCGTAGAACAGGAGG-3′;U6:上游:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;CREB:上游:5′-CCACTCAGCCGGGTACTACC-3′,下游:5′-CACCAGAGGCAGCTTGAACA-3′;BDNF:上游:5′-GCTGCTGGATGAGGACCAGA-3′,下游:5′-CCAAAA-GGCACTTGACTGCTG-3′;GAPDH:上游:5′-GTCG-ATGGCTAGTCGTAGCATCGAT-3′,下游:5′-TGCTA-GCTGGCATGCCCGATCGATC-3。RT-qPCR采用20 μl反應(yīng)體系:TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl,ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)0.4 μl,cDNA(50 ng/μl)2 μl,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl,ddH2O 6.0 μl。反應(yīng)條件為:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 34 s,40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析miR-134、CREB及BDNF mRNA相對表達(dá)量。
1.3.5海馬CREB、p-CREB、BDNF蛋白表達(dá)量檢測 Western印跡檢測各組大鼠海馬CREB、p-CREB、BDNF蛋白表達(dá)情況。采用蛋白抽提試劑盒提取海馬總蛋白,BCA試劑盒檢測蛋白濃度,置于-80℃保存?zhèn)溆谩H?0 mg蛋白樣品,80 mV電壓下6%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)2 h,250 mA下聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜70 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入適量含2%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋,加一抗anti-CREB(1∶1 000)、anti-p-CREB(1∶1 000)、anti-BDNF(1∶5 000)、anti-β-actin(1∶5 000)4℃孵育過夜,TBST緩沖液洗膜3次,每次20 min,添加二抗IgG(1∶5 000)37℃孵育1.5 h,顯色,曝片,觀察并分析各蛋白條帶灰度值。
1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。
2.1rTMS對癲癇大鼠抑郁樣行為的影響 與NC組比較,s-rTMS組不動時間顯著延長,水平站立次數(shù)及垂直站立次數(shù)顯著減少(P<0.05);與s-rTMS組比較,rTMS組不動時間顯著縮短,水平站立次數(shù)及垂直站立次數(shù)顯著增加(P<0.05),見表1。
2.2rTMS對癲癇大鼠焦慮樣行為的影響 與NC組比較,s-rTMS組TE、OE%、OT%顯著減少,攝食潛伏期顯著延長(P<0.05);與s-rTMS組比較,rTMS組TE、OE%、OT%顯著增加,攝食潛伏期顯著縮短(P<0.05),見表1。
表1 各組抑郁樣、焦慮樣行為比較
2.3rTMS對癲癇大鼠海馬miR-134、CREB及BDNF mRNA相對表達(dá)量的影響 與NC組比較,s-rTMS組miR-134相對表達(dá)量顯著降低,CREB及BDNF mRNA相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05);與s-rTMS組比較,rTMS組miR-134相對表達(dá)量顯著增加,CREB及BDNF mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05),見表2。
2.4rTMS對癲癇大鼠海馬CREB、p-CREB及BDNF蛋白表達(dá)量的影響 與NC組比較,s-rTMS組p-CREB/CREB及BDNF蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05);與s-rTMS組比較,rTMS組p-CREB/CREB及BDNF蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05),見圖1、表3。
表2 各組海馬miR-134、CREB及BDNF mRNA相對表達(dá)量比較
圖1 Western印跡檢測海馬CREB、p-CREB及BDNF蛋白表達(dá)
表3 各組海馬p-CREB/CREB及BDNF蛋白表達(dá)量比較
癲癇反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致神經(jīng)元壞死和凋亡、特異性突觸重塑、苔蘚纖維出牙等,進(jìn)而可促進(jìn)異常興奮性環(huán)路形成,發(fā)展為難治性癲癇〔12〕。近來rTMS成為抗癲癇的潛在治療手段,但文獻(xiàn)報道中rTMS治療癲癇的刺激參數(shù)各不相同,rTMS調(diào)節(jié)皮質(zhì)興奮性效應(yīng)與刺激頻率有關(guān),通常高頻(>1 Hz)可增強皮質(zhì)興奮性,而低頻(≤1 Hz)可抑制皮質(zhì)興奮性〔13,14〕,Li等〔15〕研究報道,長期間歇性低頻率rTMS可有效控制不服藥青少年癲癇患者的癲癇發(fā)作。Wang等〔16〕研究報道,低頻rTMS治療可改善癲癇大鼠抑郁、焦慮狀態(tài),但不能減輕其癲癇發(fā)作程度。而有研究報道對右頂葉皮層的1 Hz rTMS會干擾短暫出現(xiàn)刺激的感知〔17〕。本研究結(jié)果提示癲癇大鼠出現(xiàn)抑郁、焦慮樣行為,模型制備成功,可用于后續(xù)試驗;提示rTMS可顯著改善癲癇大鼠抑郁及焦慮樣行為,有一定臨床應(yīng)用價值,但對癲癇伴抑郁、焦慮樣行為障礙的影響及作用機制尚無明確定論。
miR-134是一種廣泛分布于腦內(nèi)海馬特殊小RNA,可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的微觀結(jié)構(gòu)及樹突棘大小,與癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。王倩等〔18〕研究報道,難治性癲癇患者顳葉皮質(zhì)及癲癇動物海馬中miR-134表達(dá)下降,CREB、p-CREB表達(dá)升高。Zhu等〔19〕研究報道,癲癇病大鼠海馬miR-134水平在3 d后明顯低于正常水平,并繼續(xù)維持在較低水平;而CREB和p-CREB水平在3 d后顯著升高,并繼續(xù)保持在較高水平,miR-134可通過抑制CREB和p-CREB表達(dá)抑制突觸可塑性。而Shen等〔20〕研究報道,白藜蘆醇對溫和應(yīng)激誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙神經(jīng)保護(hù)作用可能與下調(diào)miR-134、上調(diào)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)1激活SIRT1/miR-134通路,進(jìn)而上調(diào)其下游海馬區(qū)CREB/BDNF表達(dá)有關(guān)。另Chen等〔21〕研究報道,單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂通過上調(diào)SIRT1、p-CREB、BDNF表達(dá)激活發(fā)育中的雄性大鼠海馬中SIRT1/CREB/BDNF通路,改善鉛誘導(dǎo)的認(rèn)知缺陷和腦損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NC組比較,s-rTMS組miR-134相對表達(dá)量顯著降低;與s-rTMS組比較,rTMS組miR-134相對表達(dá)量顯著增加。CREB是核轉(zhuǎn)錄因子,被磷酸化活化后可進(jìn)一步激活其下游靶基因BDNF表達(dá),影響神經(jīng)元的可塑性及遞質(zhì)合成,CREB/BDNF信號通路是抑郁樣行為及認(rèn)知功能障礙性疾病中重要相關(guān)通路〔22〕。提示低頻rTMS可抑制癲癇大鼠抑郁、焦慮樣行為可能與調(diào)控miR-134/CREB/BDNF通路有關(guān),但miR-134是直接靶向CREB/BDNF通路還是通過靶向SIRT1間接影響CREB/BDNF通路在抑郁、焦慮樣行為中起作用有待進(jìn)一步驗證。
綜上,低頻rTMS可減輕癲癇大鼠抑郁、焦慮樣行為,可能與調(diào)控miR-134/CREB/BDNF通路有關(guān)。