蒙藥壯西-4味散對維甲酸誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松的治療作用

圖布新 辛穎 李桂花 瑟·道爾吉巴圖 色·色日道爾吉

(1內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2蒙古國國立醫(yī)科大學(xué)；3內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院)

骨質(zhì)疏松威脅著人類的生活與生存質(zhì)量，是由多種因素引起的以骨密度(BMD)下降和骨微結(jié)構(gòu)破壞為主要特征的系統(tǒng)性骨病，發(fā)病機制尚未完全闡明，骨吸收和骨形成都與之相關(guān)〔1，2〕。

蒙醫(yī)對“骨枯癥”的發(fā)病機制及臨床表現(xiàn)的描述與骨質(zhì)疏松相符。蒙醫(yī)認為“骨枯癥”是一種病因眾多而復(fù)雜的全身疾病〔3,4〕，治療以辨證施治為原則，通過健脾養(yǎng)胃、改善消化，促進食物的吸收是治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵〔5〕。蒙藥壯西-4味散，記載于《中國醫(yī)學(xué)百科全書·蒙醫(yī)卷》中，由寒水石、肉蓯蓉、冰糖和地格達組方〔6〕，具有清“協(xié)日”、消食止吐、止瀉等功效。目前，臨床上依據(jù)蒙醫(yī)理論結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)評價指標(biāo)，應(yīng)用蒙藥壯西-4治療骨質(zhì)疏松的療效較好〔7〕?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為基礎(chǔ)補鈣是骨質(zhì)疏松治療關(guān)鍵，有研究發(fā)現(xiàn)壯西-4的單藥寒水石富含硫酸鈣，能夠激活成骨細胞活性，增加骨保護素，促進骨吸收〔8〕。單藥肉蓯蓉具有一定的滋補作用，通過多通路發(fā)揮雌激素樣作用而對抗骨質(zhì)疏松〔9,10〕。單藥地格達可作用于胃臟，保證機體清濁代謝的順利進行。鑒于此，蒙藥壯西-4可能通過補充鈣離子(Ca2+)以調(diào)節(jié)骨礦物質(zhì)的代謝；通過發(fā)揮雌激素樣作用、增強胃臟對藥物的吸收等方面治療骨質(zhì)疏松〔11,12〕。本研究通過建立維甲酸所致骨質(zhì)疏松大鼠模型，觀察蒙藥壯西-4味散對骨質(zhì)疏松的治療作用，旨在為其進一步的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1實驗動物 SD雌性大鼠60只，體重180～200 g，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(遼)2015-0001。

1.2藥物與試劑 壯西-4味散(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室，批號M15060996)；鈣爾奇D片(德國，批號190003887)；維甲酸(陜西森弗生物技術(shù)有限公司，批號SCI120308-03)；Ca測試盒(南京建成生物工程研究所，批號20181221)；磷(P)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號20181227)；雌激素(E2)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號20181222)；降鈣素(CT)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號20190118)；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(浙江伊利康生物技術(shù)有限公司，批號A059-1)。

1.3主要儀器 X射線BMD檢測儀(Lunar iDXA，美國GE Medical Systems Ultrasound & Primary CareDiagnostics LLC)；全自動多功能酶標(biāo)儀(MK3，芬蘭雷勃)；全自動生化分析儀(AU640，日本OLYPUS公司)；組織石蠟包埋機(SYD-B，沈陽譽德電子儀器有限公司)；低速自動平衡離心機(DT5-5，北京時代北利離心機有限公司)；全譜直讀艾離子體發(fā)射光譜儀(prodigyxp，美國俐謾公司)；光學(xué)顯微鏡(BX51，日本OLYPUS公司)。

1.4動物分組和模型制作 雌性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機分為6組：正常對照組，模型組，陽性藥物組和壯西-4味散低、中、高劑量組，每組10只。除正常對照組外，其余各組大鼠每天灌胃維甲酸70 mg/kg〔13〕，給藥周期為14 d。給藥結(jié)束后選取空白對照組和模型組大鼠，用CT掃描進行BMD分析，測定血清中ALP水平，以檢測是否造模成功。模型成功后，陽性藥物組給予鈣爾奇D片混懸液(1.322 g/kg)、壯西-4味散低、中、高劑量組分別給予壯西-4味散(0.514 g/kg、1.056 g/kg、2.112 g/kg)，正常對照組和模型組均給予蒸餾水，連續(xù)給藥14 d后處死動物。

1.5主要觀察指標(biāo) (1)一般情況。造模及藥物治療前后仔細觀察大鼠體毛色澤、神志、四肢活動、食量增減、體重變化。(2)BMD檢測。常規(guī)麻醉大鼠后使其四肢展開俯臥在X射線BMD儀的掃描床上，打開電腦終端的小動物BMD檢測軟件系統(tǒng)，進行全身BMD掃描，得到頭、上肢、大腿、軀干、肋骨、脊柱、骨盆、全身的BMD，通過儀器自帶軟件進行大腿BMD分析。(3)尿中Ca和P測定。大鼠處死前1 d置于代謝籠中收集24 h尿液，-20℃保存待測。(4)血清指標(biāo)的測定。選擇腹主動脈采血，分離血清，全自動生化分析儀檢測血清中Ca、P、ALP、E2和CT含量。(5)形態(tài)檢查。處死動物后取其右側(cè)的股骨，去掉附著的軟組織后固定于10%甲醛溶液，固定24 h后，鋸下近端1/3放入10%硝酸液中，脫Ca 6～8 h，流水沖洗2～4 h，常規(guī)脫水。按股骨的長軸包埋，用切片機沿肌長軸切片，切片厚度5 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色后光鏡觀察。在低倍(10 × 40倍)視野下測定骨小梁面積。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般情況 給藥14 d時，正常對照組大鼠活動正常、靈活、毛色光澤，而模型組與正常對照組相比，大鼠活動明顯減少，體重顯著減輕〔(263.23±15.43)g vs (257.59±10.01)g,P<0.05〕，食量減少，反應(yīng)遲鈍體毛枯疏；陽性藥物組及壯西-4味散低、中、高劑量組與模型組比較活動較多，毛色較好，體重顯著增高〔(268.13±10.96)g、(266.82±11.33)g、(264.83±17.88)g、(269.30±11.33)g，P<0.05〕，與正常對照組無明顯差異(P>0.05)。

2.2骨質(zhì)疏松模型建立成功 與正常對照組比較，模型ALP明顯增高(P<0.05)，BMD顯著降低(P<0.01)。見表1。結(jié)果表明骨質(zhì)疏松模型造模成功。

表1 造模14 d維甲酸對大鼠血清ALP、BMD指標(biāo)的影響

2.3壯西-4味散對大鼠BMD的影響 與正常對照組比較，模型組BMD顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，各給藥組BMD顯著增高(P<0.05)，見表2。

2.4壯西-4味散對骨質(zhì)疏松大鼠尿中Ca和P的影響 與正常對照組比較，模型組尿中Ca、P顯著增高(P<0.05)；各給藥組與模型組比，Ca、P明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.5壯西-4味散對骨質(zhì)疏松大鼠血清中Ca和P的影響 與正常對照組比較，模型組血清Ca、P明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥物組和壯西-4味散中、高劑量組血清中的Ca、P水平均顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 壯西-4味散對骨質(zhì)疏松大鼠BMD、Ca、P、血清骨代謝因子的影響

2.6壯西-4味散對骨質(zhì)疏松大鼠血清中骨代謝因子的影響 與正常對照組比較，模型組血清ALP明顯增高(P<0.05)，E2、CT明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥物組和壯西-4味散低、中、高劑量組血清中的E2、CT均顯著升高(P<0.05)，ALP水平均顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.7各組股骨骨小梁面積 與正常對照組〔(52.22±1.21)%〕比較，模型組股骨骨小梁面積〔(29.79±4.95)%〕明顯變小(P<0.01)；與模型組比較，壯西-4味散低、中、高組和陽性藥物組骨小梁面積顯著增多〔(39.43±4.19)%、(45.86±4.48)%、(46.78±7.66)%、(36.87±8.06)；P<0.05〕。

2.8各組股骨骨組織病理形態(tài)學(xué) 光鏡下觀察顯示，正常對照組可見骨小梁豐富、飽滿；模型組大鼠骨小梁稀少、變細；各給藥組骨小梁比模型組有所增寬。見圖1。

圖1 各組股骨骨組織病理形態(tài)學(xué)(HE染色，×400)

3 討 論

維甲酸又稱維生素A酸，是維生素A的衍生物，可激活破骨細胞而促進骨吸收，導(dǎo)致BMD下降。維甲酸灌胃14 d后就即可出現(xiàn)骨松質(zhì)和骨皮質(zhì)容量明顯減少，骨組織微結(jié)構(gòu)的病理改變，骨小梁數(shù)量下降，骨小梁分離，骨髓腔增大，皮質(zhì)骨變薄和BMD降低。采用維甲酸制作的骨質(zhì)疏松實驗?zāi)Ｐ退钑r間短，雖然在病因上與人類骨質(zhì)疏松不同，但此模型在發(fā)病癥狀、組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及對E2的骨反應(yīng)上與人類有較大的相似性，是大鼠急性骨質(zhì)疏松的常用模型，在藥物的開發(fā)研究中被普遍采用〔14〕。

BMD降低是骨質(zhì)疏松的重要表現(xiàn)之一，因此BMD可以作為骨質(zhì)疏松的評判標(biāo)準之一，也可以作為評價骨質(zhì)疏松療效的客觀指標(biāo)。臨床上雙能X線BMD儀檢測BMD為診斷骨質(zhì)疏松的金標(biāo)準〔15〕。因其測值準確且操作靈活，同樣適應(yīng)于實驗鼠的檢測〔16,17〕。

空腹尿Ca、P主要來源于骨鹽的分解，故其排出量可反映骨吸收的狀況，壯西-4味散可以抑制維甲酸致骨Ca流失。體內(nèi)Ca、P 95%聚集在骨骼中，骨骼中Ca、P的含量受到血Ca、P、激素調(diào)節(jié)、外部補充等的影響。壯西-4味散可提高血中的Ca、P含量，可能是其屬于含Ca類藥物。

血清ALP含量是常用的評價骨形成和骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo)。血清中ALP有50%來自于骨，骨ALP由成骨細胞分泌，而另一半絕大部分來源于肝臟。血清 ALP活性可反映成骨細胞活躍情況。壯西-4味散可以降低血清ALP，具有抑制骨吸收，降低骨轉(zhuǎn)換，提高骨質(zhì)量的作用。

E2可與成骨細胞上E2受體相結(jié)合，促進細胞骨保護素(OPG)表達增加，OPG是核因子κB受體活化因子(RANK)配體(RANKL)-RANK-OPG軸的重要因素，OPG不僅可以促進破骨細胞凋亡，還可以與RANKL競爭性結(jié)合RANK，抑制破骨細胞生成分化〔18，19〕。當(dāng)E2缺乏時，可引起RANK/RANKL信號通路過度激活，促進破骨細胞分化，導(dǎo)致骨吸收增加。含E2類中藥可通過類E2樣作用增加骨Ca、P含量，提高BMD而達到防治骨質(zhì)疏松的作用〔20〕。CT由甲狀腺濾泡旁細胞產(chǎn)生和分泌，是參與Ca、P代謝調(diào)節(jié)的多膚類激素。其主要生理作用是降低破骨細胞的數(shù)量，抑制破骨細胞的活性，減少骨吸收；同時可抑制小腸對Ca2+的吸收，降低體內(nèi)血Ca濃度，使血中游離Ca向骨組織中轉(zhuǎn)化〔21〕。CT對成骨細胞具有直接作用，可以增加成骨細胞ALP的活性，促進骨的形成和礦化過程。通過對成骨細胞的調(diào)節(jié)，促進成骨細胞增殖和分化，有利于骨形成，增加BMD〔22〕。壯西-4味散可通過升高E2和CT水平達到治療骨質(zhì)疏松的作用。

骨組織強度與骨量有關(guān)，還與骨組織結(jié)構(gòu)關(guān)系密切〔23〕。骨量減少是骨質(zhì)疏松的主要病理變化之一，亦是引起骨質(zhì)疏松骨折的一個主要原因。本實驗結(jié)果顯示，壯西-4味散能有效阻止維甲酸導(dǎo)致的骨礦物丟失和骨組織纖維結(jié)構(gòu)的改變，阻止骨質(zhì)量降低。

綜上所述，壯西-4味散能有效升高維甲酸所致骨質(zhì)疏松模型大鼠的血Ca、P，降低尿Ca、P，增加BMD，抑制骨吸收，促進骨形成，改善骨代謝的負平衡狀態(tài)，對維甲酸導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松具有良好的治療作用。其防治作用機制可能是蒙藥壯西-4味散有一定的提高血Ca、P的鈣劑作用，也可能是通過E2樣作用補充E2，通過提高血液中的CT水平，并與其結(jié)合，在多種激素聯(lián)合作用Ca、P代謝，提高BMD而達到防治骨質(zhì)疏松的效果。