危柳柳 賴月亮 朱方擎 林曄 謝俊峰
(贛州市人民醫(yī)院,江西 贛州 341000)
早期胃癌被定義為腺癌局限于胃黏膜或黏膜下層淋巴結(jié)存在或不存在轉(zhuǎn)移,其生物學(xué)行為與進(jìn)展期胃癌相比相對良性,目前尚不清楚在2個(gè)腫瘤之間是否存在不同的致癌途徑,是否與癌癥發(fā)生的早期和晚期有關(guān)〔1,2〕。在胃的發(fā)育過程中,胃上皮細(xì)胞凋亡的平衡增殖受到干擾,過度的B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2原癌基因和突變P53蛋白積累〔3〕,兩者都在胃癌前病變向癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)中起著至關(guān)重要的作用〔4〕。大多數(shù)早期和晚期胃上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化癌癥數(shù)據(jù)來自日本和東亞,來自西方的人口是有限的〔5〕。本研究探討miR-21通過Bcl-2和P53對早期胃癌病理形態(tài)學(xué)的影響。
1.1臨床標(biāo)本 江西省贛州市人民醫(yī)2018年1月至2019年7月期間接受治療的早期胃癌患者60例。早期胃癌納入標(biāo)準(zhǔn):①依據(jù)為病理,確診為早期胃癌;②尚未發(fā)生早期胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移;③年齡48~60歲;④所有患者知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①處于復(fù)發(fā)性早期胃癌;②術(shù)前檢查有感染和轉(zhuǎn)移;③有其他惡性腫瘤合并;④有肝腎、心血管系統(tǒng)等重大疾病。從每例患者身上取得的癌組織于半小時(shí)內(nèi)分別放入10%甲醛溶液中固定并且石蠟包埋。
1.2主要材料 免疫組化皆使用單克隆抗體,Envision染色系統(tǒng)、抗Bcl-2、抗P53(美國BMI公司);蘇木素-伊紅(HE)染色,無水乙醇,稀氨水,二甲苯。
1.3分組 60例早期胃癌患者取得的癌組織通過增加和減少miR-21表達(dá)水平分為過表達(dá)miR-21組和敲低miR-21組各30例,并隨機(jī)選取兩組各15例患者的癌旁正常組織作為對照組(30例)。
1.4Western印跡 使用RIPA緩沖液(Solarbio,R0010,上海)和抑制劑混合物(Sigma,P8340-5ML,St.Louis,MO,USA)提取細(xì)胞和組織的總蛋白質(zhì)并測定通過二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)測定法測定蛋白質(zhì)濃度(SBJ-1001;Beyotime,SENBEIJIA Bio,南京)〔6〕。加入上樣緩沖液以調(diào)節(jié)濃度。變性后,向每個(gè)樣品孔中加入20 μg。使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS、PAGE)分離蛋白質(zhì)樣品,然后在電泳和跨膜后用聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)移相應(yīng)的蛋白質(zhì),用脫脂乳密封2 h〔7〕。將膜與抗-Smurf1(PB0937,1∶1 000;武漢博士德生物技術(shù)有限公司,武漢)和抗β-微管蛋白(2146,1∶1 000;Cell Signaling Technology,Inc.,Danvers,MA)一起孵育初級(jí)抗體〔8〕。β-微管蛋白用作上樣對照。在4℃下過夜孵育。將PVDF膜洗滌3次,加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔抗體(抗兔IgG,HRP連接抗體6402-05,1∶5 000;Amylet Scientific Inc,武漢),并在37℃溫育。持續(xù)1~2 h。使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)著色劑(Haigene,M2301,哈爾濱)使條帶可視化〔9〕。分析靶蛋白β-微管蛋白的灰度比,表明目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對含量。
1.5免疫組化 針對結(jié)直腸癌組織的免疫組化,樣本取自癌癥最具侵襲性的區(qū)域〔9〕。將標(biāo)本固定在10%甲醛溶液中,包埋在石蠟中,并切成4 μm厚的切片。4 μm厚的切片在二甲苯中脫蠟,并在分級(jí)系列乙醇中再水合。切片用2%脫脂乳和5%牛血清白蛋白在磷酸鹽緩沖鹽水中孵育,以阻斷免疫試劑的非特異性結(jié)合。隨后,在室溫下與單克隆抗MMPs抗體作為一級(jí)抗體。然后,用0.3% H2O2處理,抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性30 min,并進(jìn)行標(biāo)記鏈霉親和素生物素技術(shù)。用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為顯色劑,對其進(jìn)行評估。
1.6組織學(xué)評估 基于德國免疫反應(yīng)評分〔10〕。染色強(qiáng)度的等級(jí)從0到3,0、1、2或3分別表示無染色、弱染色、中等染色或強(qiáng)染色。陽性細(xì)胞的百分比評分如下:無染色為0分,1%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,76%~100%為4分。通過將染色強(qiáng)度所得的分?jǐn)?shù)乘以陽性細(xì)胞百分比所得的分?jǐn)?shù)來計(jì)算最終分?jǐn)?shù),結(jié)果范圍為0~12分。為了將強(qiáng)度評分與臨床病理因素進(jìn)行比較,最終評分0~5分被認(rèn)為是低表達(dá),6~12分被為高表達(dá)。組織學(xué)和免疫組化評估由2名不知道患者臨床特征的觀察者獨(dú)立進(jìn)行。在觀察者意見不一致的情況下,評估由額外的觀察者進(jìn)行。
1.7HE染色 將早期胃癌組織切片,二甲苯Ⅰ脫蠟進(jìn)行10 min,此后用二甲苯Ⅱ脫蠟5 min,完成之后用無水乙醇洗去二甲苯,重復(fù)清洗3遍,用95%乙醇清洗1 min,90%乙醇清洗1 min,最后用蒸餾水清洗掉乙醇。用蘇木素進(jìn)行染色,保持1 min,再用清水洗滌1 min,1%鹽酸酒精分化20 s,清水洗滌3 min,再用1%氨水反藍(lán)30 s,清水洗滌1 min,伊紅染色20 s,清水洗滌1 min,然后用85%乙醇脫水20 s,90%乙醇脫水30 s,95%乙醇Ⅰ脫水1 min,95%乙醇Ⅱ 1 min,無水乙醇Ⅰ脫水2 min,無水乙醇Ⅱ脫水2 min,無水乙醇Ⅲ脫水2 min,最后分別用二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ處理2 min,用中性樹膠封片完成即可。
1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、χ2檢驗(yàn)。
2.1miR-21通過Bcl-2和P53對癌組織HE染色的影響 過表達(dá)miR-21組胃體和胃竇部黏膜炎癥較輕,輕微水腫,上皮細(xì)胞壞死脫落,黏膜淺層有淋巴細(xì)胞浸潤,固有腺體完整;敲低miR-21組病變黏膜固有層內(nèi)慢性炎細(xì)胞浸潤,深達(dá)黏膜肌層,血管增生,基底部腺體上皮增生,出現(xiàn)共壁現(xiàn)象。見圖1。過表達(dá)miR-21組的病理組織學(xué)情況顯著優(yōu)于敲低miR-21組(P<0.05)。見表1。
2.2miR-21通過Bcl-2和P53對癌組織免疫組化的影響 過表達(dá)miR-21組中小部分細(xì)胞的胞質(zhì)染色,呈黃色、棕黃色、棕色、褐色;敲低miR-21組中大部分細(xì)胞染色,呈棕色和褐色,在不典型增生、腸化生細(xì)胞中呈深褐色。見圖2。
圖1 miR-21通過Bcl-2、P53對癌組織HE染色的影響(×200)
表1 兩組病理組織學(xué)情況對比(n=30)
圖2 miR-21通過Bcl-2、P53對癌組織免疫組化的影響(×200)
2.3各組Bcl-2、P53的蛋白表達(dá)比較 與對照組Bcl-2、P53蛋白表達(dá)(0.48±0.03、0.38±0.07)相比,過表達(dá)miR-21組Bcl-2蛋白表達(dá)(0.17±0.02)顯著降低,P53蛋白表達(dá)(0.96±0.13)顯著上升(P<0.05);敲低miR-21組Bcl-2蛋白表達(dá)(0.63±0.04)顯著上升,P53蛋白表達(dá)(0.27±0.04)顯著降低(P<0.05)。見圖3。
圖3 各組Bcl-2和P53蛋白表達(dá)
早期胃癌患者進(jìn)行手術(shù)后的生存率可超過90%〔11〕,而轉(zhuǎn)移性早期胃癌患者的淋巴結(jié)有1%~3%的局限于胃黏膜,11%~20%局限于胃黏膜下層〔12〕。 診斷是指經(jīng)驗(yàn)豐富的中心使用高靈敏度和特異性的內(nèi)鏡對腫瘤的浸潤程度進(jìn)行評估〔13〕,判斷癌癥的發(fā)展進(jìn)程。對胃癌患者進(jìn)行早診斷、早治療能夠大大提高胃癌患者的生存率、預(yù)后水平,因此研究相關(guān)診斷指標(biāo)對胃癌臨床治療具有重要意義〔14〕。
目前只有少數(shù)指標(biāo)被報(bào)道可用于胃癌早期診斷,最近有報(bào)道表明,細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因?qū)ξ赴┑陌l(fā)展及預(yù)后有影響〔15〕。Bcl-2蛋白被報(bào)道能夠通過阻斷程序性細(xì)胞死亡延長各種細(xì)胞的存活時(shí)間,有研究表明,Bcl-2過表達(dá)能夠促進(jìn)胃上皮異常增生,導(dǎo)致胃上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化〔16〕。另外,P53是正常細(xì)胞增殖的重要調(diào)控因子,野生型P53基因是一種抑癌基因,能夠修復(fù)損傷的DNA、促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔17〕,但突變型P53基因是一種癌基因,抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,突變型P53 蛋白質(zhì)常被免疫組化檢測〔18〕,有西方學(xué)者研究表明,P53蛋白在晚期胃癌的表達(dá)中高于早期胃癌〔19,20〕,提示P53蛋白在胃癌發(fā)展進(jìn)程中具有重要作用。目前已知,miR-21在多種腫瘤組織中均呈現(xiàn)高表達(dá),且能夠作用于Bcl-2與P53等靶點(diǎn)。
本研究結(jié)果顯示,miR-21在早期胃癌組織內(nèi)的過表達(dá)會(huì)顯著升高腫瘤組織內(nèi)P53蛋白的表達(dá)量、降低Bcl-2蛋白的表達(dá)量,而高表達(dá)P53蛋白和低表達(dá)的Bcl-2蛋白都能起到促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用,二者共同發(fā)揮抑癌作用優(yōu)化了胃癌組織的病理學(xué)形態(tài),延緩了早期胃癌的發(fā)展進(jìn)程,說明在臨床能夠通過檢測或調(diào)控miR-21水平對早期胃癌患者進(jìn)行診斷治療。
綜上,miR-21能夠通過升高P53表達(dá)、降低Bcl-2表達(dá)改善早期胃癌患者胃內(nèi)理化環(huán)境,減少理化損傷,miR-21也可以作為早期胃癌檢查的指標(biāo),對患者的臨床治療有一定意義,但本研究設(shè)計(jì)并未涉及對于Bcl-2與P53作用機(jī)制的研究,關(guān)于miR-21通過Bcl-2和P53對早期胃癌的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。