miR-520f-3p靶向MCL1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及移植瘤發(fā)生

陶正貴 杜靜虎 田葵 王東華 胡鳳琪 陳滿宇

(湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 襄陽(yáng)市中心醫(yī)院 1普外科，湖北 襄陽(yáng) 441000；2腎內(nèi)科)

在世界范圍內(nèi)，結(jié)腸癌是全世界癌癥死亡的第二大主要原因〔1〕。結(jié)腸癌特征是結(jié)腸部分細(xì)胞的異常凋亡和惡性生長(zhǎng)，結(jié)腸癌的常用治療方法是手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法和靶向療法〔2〕。由于人們生活水平的提高、飲食的變化、多脂食品和多糖食品等食品的消費(fèi)增加、生活節(jié)奏加快、工作壓力增加和環(huán)境污染，結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年增加〔3〕。盡管在結(jié)腸癌的治療方面取得了顯著進(jìn)展，結(jié)腸癌的5年生存率已超過(guò)60%，但在治療過(guò)程中仍然存在很多問(wèn)題〔4〕。鑒于此，迫切需要更有效和新穎的結(jié)腸癌治療藥物和策略。miRNA參與了許多細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié)，包括代謝穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡〔5〕。miRNA的異常表達(dá)已經(jīng)與多種人類疾病的發(fā)病機(jī)制緊密相關(guān)，幾乎所有類型的癌癥都存在。miRNA在癌癥發(fā)展中的作用相當(dāng)復(fù)雜，miRNA既可以通過(guò)抑制腫瘤抑制基因充當(dāng)癌基因，也可通過(guò)負(fù)調(diào)控癌基因mRNA發(fā)揮腫瘤抑制作用〔6〕，其中miR-520f-3p是有效的mRNA之一。已有研究表明，miR-520f-3p靶向性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)9抑制胃癌細(xì)胞增殖〔7〕；也有研究表明miR-520f-3p通過(guò)負(fù)調(diào)控高氨酸拉鏈下調(diào)因子(LDOC)1增加膠質(zhì)瘤的干性〔8〕。但miR-520f-3p在結(jié)腸癌中的作用尚不清楚。本文主要研究miR-520f-3p對(duì)結(jié)腸癌的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 miR-NC、pc-NC、miR-520f-3p mimic、miR-520f-3p inhibitor、pc-髓樣細(xì)胞白血病蛋白(MCL)1質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)所用各種引物由北京奧科生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(上海少辛生物科技有限公司，貨號(hào)：11668-019)，胎牛血清(北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)：QS071)，RPMI1640培養(yǎng)基(北京清大天一科技有限公司，貨號(hào)：MD800)，青霉素和鏈霉素雙抗溶液(北京沃比森科技有限公司，貨號(hào)：C0160-611)，SYBR-Green聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(嘉興藍(lán)諾盛生物科技有限公司，貨號(hào)：RT0411-03)，RIPA裂解緩沖液(上海雅酶生物科技有限公司，貨號(hào)：PC101)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(北京威格斯生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：T002)，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(西安浩特生物科技有限公司，貨號(hào)：WB027)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、Ki67、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、cleaved caspase-3、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、MCL1抗體(上海艾博抗生物科技有限公司，貨號(hào)：ab36151、ab92742、ab18197、ab2302、ab32503、ab182858、ab32087)，裸鼠購(gòu)自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司，許可證：SYXK(川)2017-203。FluorChem HD2凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Proteinsimple公司，BS-1101全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自北京華泰和合商貿(mào)有限公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，Seahorse XF24分析儀購(gòu)自美國(guó)Seahorse公司。

1.2細(xì)胞及培養(yǎng) 正常結(jié)腸上皮細(xì)胞HCoEpiC和結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT-29、SW480、LOVO、HCT15、Colo205、SW620)均購(gòu)自上海素冉生物科技有限公司。在37℃、5% CO2條件下，所有細(xì)胞于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素和鏈霉素雙抗溶液的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3組織樣品 在2018年2月至2020年2月期間，從湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院行腫瘤瘤切除術(shù)的患者中獲取組織。該研究得到醫(yī)院研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并根據(jù)《赫爾辛基宣言》的道德準(zhǔn)則進(jìn)行，且獲得患者同意并簽訂知情同意書。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量(RT-q)PCR檢測(cè)miR-520f-3p mRNA表達(dá) 將正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織剪碎并研磨，然后裂解提取總RNA。對(duì)于細(xì)胞，將正常結(jié)腸上皮細(xì)胞HCoEpiC和結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT-29、SW480、LOVO、HCT15、Colo205、SW620)接種在12孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到近85%融合時(shí)，用RIPA裂解提取總RNA。用 cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板按SYBR-Green PCR試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行RT-qPCR。miR-520f-3p的循環(huán)條件為：95℃ 15 s和61℃ 35 s的40個(gè)循環(huán)，用U6標(biāo)準(zhǔn)化。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)分析。引物序列為：miR-520f-3p正義鏈：5′- ACACTCCAGCTGGGCCTCTAAAGGGAAGCG-3′，反義鏈：5′-CTCAA CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAG-3′；U6正義鏈：5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義鏈：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)期結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，以每孔1×106密度接種于12孔板。當(dāng)達(dá)到85% 融合，根據(jù)Lipofectamine2000說(shuō)明書按照分組將miR-NC、miR-520f-3p mimic、miR-520f-3p inhibitor和pc-NC、pc-MCL1質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染進(jìn)入HT-29細(xì)胞。

1.6克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)能力 將1.5轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞接種于6孔板，每孔1×106，直到生長(zhǎng)至可見(jiàn)克隆細(xì)胞。用甲醇固定可見(jiàn)克隆細(xì)胞，0.25% 結(jié)晶紫染色30 min，計(jì)數(shù)克隆細(xì)胞數(shù)量。

1.7流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取1.5轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，離心收集細(xì)胞，并按1×106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸。細(xì)胞懸液中加入5 μl FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和碘化啶，避光孵育15 min，然后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.8裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn) 所有裸鼠分為4組：Control組、miR-NC組、miR-520f-3p mimic組、miR-520f-3p inhibitor組。在每只裸鼠左腋下皮下注射100 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中5×106各轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，繼續(xù)在SPF條件下正常飲食飼養(yǎng)〔9〕。第30天頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤，測(cè)定移植瘤體積和重量，TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western印跡檢測(cè)Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平。其中移植瘤體積測(cè)量方法是用游標(biāo)卡尺分別測(cè)出a：長(zhǎng)徑；b：寬徑；c：高，再用公式：V=πabc/6進(jìn)行計(jì)算。

1.9Western印跡檢測(cè)Ki67、PCNA、 cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2和MCL1蛋白表達(dá)水平 收集1.5轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞和1.8移植瘤組織。用RIPA裂解液裂解細(xì)胞和組織并提取總蛋白。然后用BCA試劑盒定量蛋白的濃度。將蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，再用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜，室溫下于脫脂牛奶中封閉蛋白2 h。接著加入對(duì)應(yīng)的兔來(lái)源的單克隆一抗(Ki67 1∶1 000、PCNA 1∶1 500、cleaved caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶800、Bcl-2 1∶1 000、MCL1 1∶1 000)，于4℃ 封閉過(guò)夜。然后，加入對(duì)應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔單克隆二抗(1∶2 000)室溫封閉1 h，最后滴電化學(xué)反應(yīng)液曝光。以GAPDH為內(nèi)參，使用軟件ImagePro Plus6.0分析蛋白條帶灰度，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白積分吸光度值/內(nèi)參蛋白GAPDH積分吸光度值。

1.10TUNEL染色檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡 取移植瘤組織固定后，常規(guī)石蠟切片，玻片預(yù)先用多聚賴氨酸處理以防止脫片。切片脫蠟入水后按TUNEL染色試劑盒內(nèi)使用說(shuō)明操作，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，常規(guī)脫水、透明、封片，光鏡下檢查。棕褐色細(xì)胞代表凋亡細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.11免疫組化檢測(cè)Ki67陽(yáng)性表達(dá)水平 石蠟切片經(jīng)脫蠟水化，過(guò)氧化物酶阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，加入兔來(lái)源Ki67單克隆抗體(1∶250)，4℃過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記二抗，DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片觀察統(tǒng)計(jì)。著色為棕黃色的表示細(xì)胞陽(yáng)性。隨機(jī)選取5個(gè)視野用Image J計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率(%)。

1.12雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)靶向關(guān)系 收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，接種于24孔板中，并在37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。然后，將1 μg PGL3-MCL1-WT(MCL1野生型)或PGL3- MCL1-MUT(MCL1突變型)及miR-NC或miR-520f-3p mimic和PRL-CMV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞裂解15 min，雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量熒光素酶的相對(duì)活性，熒光素酶的相對(duì)活性(R/F)=螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/腎熒光素酶活性。

1.13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-520f-3p在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況 與正常結(jié)腸組織(0.45±0.07)相比，結(jié)腸癌組織中miR-520f-3p 的mRNA表達(dá)(0.45±0.07)顯著下調(diào)(P<0.01)；與人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞HCoEpiC(1.00±0.08)相比，結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT-29、SW480、LOVO、HCT15、Colo205、SW620)中miR-520f-3p 的mRNA表達(dá)(0.34±0.07、0.42±0.08、0.51±0.09、0.38±0.06、0.47±0.08、0.44±0.09)顯著下調(diào)(均P<0.01)，選取HT-29細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2miR-520f-3p對(duì)HT-29細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與Control相比，miR-NC組HT-29細(xì)胞克隆細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞凋亡率均無(wú)明顯變化(P>0.05)；miR-520f-3p mimic組HT-29細(xì)胞克隆細(xì)胞數(shù)目顯著減少，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.01，見(jiàn)表1，圖1)；miR-520f-3p inhibitor組HT-29細(xì)胞克隆細(xì)胞數(shù)目顯著增加，細(xì)胞凋亡率顯著減少(P<0.01，表1，圖2)。進(jìn)一步運(yùn)用Western印跡檢測(cè)HT-29細(xì)胞中增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。與Control組相比，miR-NC組HT-29細(xì)胞中Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯變化(P>0.05)；miR-520f-3p mimic組HT-29細(xì)胞中Ki67和PCNA蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(均P<0.01)，miR-520f-3p inhibitor組HT-29細(xì)胞中Ki67和PCNA蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(均P<0.01，見(jiàn)表2，圖3)。

表1 miR-520f-3p對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞克隆形成和凋亡率的影響

圖1 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖(結(jié)晶紫染色，×100)

圖2 流式檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

表2 各組HT-29細(xì)胞中增殖與凋亡相關(guān)蛋白的影響

1～4：Control組、miR-NC組、miR-520f-3p mimic組、miR-520f-3p inhibitor組圖3 Western印跡檢測(cè)Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

2.3miR-520f-3p對(duì)結(jié)腸癌HT-29移植瘤生長(zhǎng)的影響 與Control組相比，miR-NC組結(jié)腸癌HT-29移植瘤體積和重量、細(xì)胞凋亡率、Ki67陽(yáng)性細(xì)胞百分率均無(wú)明顯變化(P>0.05)；miR-520f-3p mimic組結(jié)腸癌HT-29移植瘤重量和體積顯著減少，細(xì)胞凋亡率顯著增加，Ki67陽(yáng)性細(xì)胞百分率顯著降低(均P<0.01)；miR-520f-3p inhibitor組結(jié)腸癌HT-29移植瘤重量和體積及Ki67陽(yáng)性細(xì)胞百分率顯著增加，細(xì)胞凋亡率顯著減少(均P<0.01)。見(jiàn)圖4，表3，圖5，圖6。進(jìn)一步運(yùn)用Western印跡檢測(cè)了腫瘤組織中增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。與Contro組相比，miR-NC組結(jié)腸癌HT-29移植瘤組織中Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯變化(P>0.05)；miR-520f-3p mimic組結(jié)腸癌HT-29移植瘤組織中Ki67和PCNA蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(均P<0.01)；miR-520f-3p inhibitor組結(jié)腸癌HT-29移植瘤組織中Ki67和PCNA蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(均P<0.01)。見(jiàn)表4，圖7。

2.4miR-520f-3p和MCL1靶向關(guān)系 通過(guò) Targetscan軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-520f-3p與MCL1具有靶向關(guān)系，在3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)；通過(guò)雙熒光素酶發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組(1.00±0.07)相比，miR-520f-3p mimic與PGL3-MCL1-WT共轉(zhuǎn)染使熒光素酶活性(0.41±0.08)顯著降低(P<0.01)。與Control組(0.58±0.05)相比，miR-NC組(0.56±0.06)和pc-NC組HT-29細(xì)胞中MCL1表達(dá)(0.57±0.06)無(wú)明顯變化(P>0.05)，miR-520f-3p mimic組HT-29細(xì)胞中MCL1表達(dá)(0.01±0.07)顯著下調(diào)，pc-MCL-1組HT-29細(xì)胞中MCL1表達(dá)(0.86±0.08)顯著上調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)圖8。

圖4 各組移植瘤

表3 miR-520f-3p對(duì)HT-29移植瘤生長(zhǎng)的影響

圖5 TUNEL染色檢測(cè)各組移植瘤細(xì)胞凋亡(×200)

圖6 免疫組化檢測(cè)各組Ki67表達(dá)水平(×200)

表4 miR-520f-3p對(duì)腫瘤組織中增殖與凋亡相關(guān)蛋白的影響

圖7 蛋白印跡法檢測(cè)Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

A：Targetscan軟件預(yù)測(cè)miR-520f-3p與MCL1靶向關(guān)系；B：Western印跡法檢測(cè)MCL1蛋白表達(dá)水平;1～5:Control組、miR-NC組、miR-520f-3p mimic組、pc-NC組、pc-MCL1組圖8 miR-520f-3p和MCL1靶向關(guān)系

2.5MCL1過(guò)表達(dá)對(duì)miR-520f-3p在HT-29細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與miR-520f-3p mimic+pc-NC相比〔(44.15±7.14)個(gè)、(28.53±5.78)%〕，miR-520f-3p mimic+pc-MCL1組HT-29細(xì)胞克隆細(xì)胞數(shù)目〔(98.27±10.52)個(gè)〕顯著增加，細(xì)胞凋亡率〔(9.43±3.45)%〕顯著減少(P<0.01)。與miR-520f-3p mimic+pc-NC相比，miR-520f-3p mimic+ pc-MCL1組HT-29細(xì)胞中Ki67和PCNA蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖9、表5。

A：克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖(結(jié)晶紫染色，×100)；B：流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；C：Western印跡法檢測(cè)Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平；1～2：miR-520f-3p mimic+pc-NC組、miR-520f-3p mimic+pc-MCL1組圖9 MCL1過(guò)表達(dá)對(duì)miR-520f-3p在HT-29細(xì)胞增殖和凋亡的影響

表5 MCL1過(guò)表達(dá)對(duì)miR-520f-3p在腫瘤組織中增殖與凋亡相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，隨著人們生活水平的提高，結(jié)腸癌的發(fā)病率也緩慢上升〔10〕。由于miRNA在體液中穩(wěn)定，無(wú)論是在分泌的微泡中還是與載體蛋白結(jié)合，miRNA都可以作為早期癌癥診斷的生物標(biāo)志物。已有研究提出，miR-520f可作為肺癌診斷的生物標(biāo)志物〔11〕。同一RNA在不同種類的腫瘤細(xì)胞中也具有不同的作用，如在人類黑色素瘤細(xì)胞中，miR-520f通過(guò)調(diào)控Itch表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮致癌作用〔12〕；在肝癌中，miR-520f靶向TM4SF1抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，從而發(fā)揮抑癌作用〔13〕。結(jié)腸癌特征是結(jié)腸部分細(xì)胞的異常和惡性生長(zhǎng)。本研究表明，miR-520f-3p 過(guò)表達(dá)抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖及移植瘤的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，下調(diào)Ki67和PCNA蛋白表達(dá)，上調(diào)cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)；miR-520f-3p 低表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖及抑制瘤的生長(zhǎng)，并抑制細(xì)胞凋亡，上調(diào)Ki67和PCNA蛋白表達(dá)，下調(diào)cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)。Ki67和PCNA蛋白是增殖標(biāo)記蛋白，其表達(dá)量與細(xì)胞的增殖情況呈正比；cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2是凋亡標(biāo)記蛋白，其cleaved caspase-3表達(dá)量及Bax/Bcl-2表達(dá)量比值均與細(xì)胞的凋亡情況呈正比〔14〕。因此，miR-520f-3p在結(jié)腸癌中作為抑癌基因，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及移植瘤發(fā)展。這與miR-520f通過(guò)靶向ATP酶家族AAA含域蛋白2抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)結(jié)果相類似〔15〕。

miRNAs通過(guò)與靶mRNA的3′-UTR結(jié)合來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。為了更好地了解其機(jī)制，本研究通過(guò)基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-520f-3p與MCL1具有靶向關(guān)系，在3′-UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)。并通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-520f-3p與MCL1具有直接靶向關(guān)系。MCL1位于染色體lq21，是一種屬于Bcl-2家族的抗凋亡基因，通常在許多惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮致癌作用〔16〕。已有研究表明，MCL1在結(jié)腸癌中高表達(dá)，MCL1降解是靶向治療結(jié)腸癌所必需的〔17〕。已有研究表明，在膠質(zhì)瘤中，沉默MCL1基因可通過(guò)抑制磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的衰老和凋亡〔18〕；在胃癌，中miR-125b通過(guò)靶向MCL1抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲〔19〕；在骨髓瘤中，miR-126通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白MCL1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔20〕；在喉癌細(xì)胞中，miR-363的上調(diào)導(dǎo)致MCL1表達(dá)下降，可使細(xì)胞的增殖和侵襲減弱，加速細(xì)胞凋亡〔21〕。因此，通過(guò)抑制MCL1的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡是癌癥預(yù)防的一種手段。本研究這說(shuō)明miR-520f-3p通過(guò)靶向下調(diào)MCL1，來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及移植瘤的發(fā)展。這與MCL-1異常高表達(dá)與Bax和caspase-3的低表達(dá)共同抑制肝癌細(xì)胞的凋亡，并且三者在原發(fā)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用〔22〕。

綜上，miR-520f-3p靶向MCL1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及移植瘤的發(fā)展，說(shuō)明miR-520f-3p 和MCL1可作為潛在的分子治療靶點(diǎn)。但本文僅為作用機(jī)制的初步探討，具體的分子通路機(jī)制還有待研究。