參紅通絡(luò)方調(diào)控巨噬細(xì)胞極化防治動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制

石妍玉 曲婉彤 張澤鵬 陳穎

(1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心病中心)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是由脂質(zhì)蓄積引發(fā)的慢性動(dòng)脈血管壁炎癥性疾病，是心血管疾病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。目前我國約有 3.30 億心血管病患者〔1〕，已經(jīng)成為城鄉(xiāng)居民的第一位死因，是我國面臨的重大公共衛(wèi)生問題，因此干預(yù)AS迫在眉睫。巨噬細(xì)胞在AS的發(fā)生發(fā)展過程中具有至關(guān)重要的作用〔2〕。巨噬細(xì)胞可分為經(jīng)典活化的M1型、選擇性活化的M2型。研究發(fā)現(xiàn)，可通過抑制M1型巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，延緩AS斑塊形成〔3〕。AS的關(guān)鍵病機(jī)是“痰瘀伏絡(luò)”，本研究因而創(chuàng)立了以益氣化瘀、豁痰通絡(luò)解毒為核心治法的參紅通絡(luò)方。既往研究表明參紅通絡(luò)方〔4，5〕能夠縮小斑塊面積，降低斑塊內(nèi)凋亡細(xì)胞指數(shù)，抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子的活化而實(shí)現(xiàn)對(duì)AS斑塊周圍炎癥的控制，但其具體作用機(jī)制尚未完全明確。鑒于巨噬細(xì)胞發(fā)生極化后可調(diào)控炎癥因子的活化，對(duì)介導(dǎo)炎癥的發(fā)生與發(fā)展具有重要作用。因此，本研究通過檢驗(yàn)參紅通絡(luò)方對(duì)AS模型小鼠巨噬細(xì)胞極化的影響，探討該方防治AS的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康雄性ApoE-/-小鼠及C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，6周齡，每組各10只，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011，于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心二層SPF級(jí)小鼠飼養(yǎng)室中飼養(yǎng)。動(dòng)物照明時(shí)間8∶00～20∶00，晝夜交替12 h/12 h，溫度為(22±2)℃，濕度為45%～70%。本實(shí)驗(yàn)由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核通過，批準(zhǔn)編號(hào)20190048。

1.2主要試劑及儀器 人參、丹參、紅景天、金銀花、赤芍、瓜蔞、當(dāng)歸、降香購自長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房；油紅染夜、蘇木素染液、伊紅染液、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑、RIPA裂解液購自Servicebio；兔抗分化簇86(CD86)、甘露糖受體(CD206)、一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶(Arg)1及鼠抗β-actin等抗體購于英國Abcam 公司。Donatello脫水機(jī)及Giotto染色機(jī)(DIAPATH)；D1008E掌上離心機(jī)、G6004載玻片；D3024R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(DRAGONLAB)；E100顯微鏡(Nikon)；-80℃超低溫冰箱和高壓濕熱滅菌鍋(Sanyo)。

1.3飼料制備 普通維持飼料購自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：SCXK(遼)2018-0001；高脂飼料(40 kCal%脂肪,1.25%膽固醇,0.5%膽酸)購自Research Diets公司，型號(hào)為D12109C。

1.4動(dòng)物分組、造模及給藥 40只ApoE-/-小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、參紅通絡(luò)方低、中、高劑量組，取遺傳基因相同的C57BL/6小鼠10只為空白對(duì)照組，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，按照組別分別給予高脂飼料或普通飼料喂養(yǎng)7 w后，除空白對(duì)照組外，各組隨機(jī)抽取1只，取主動(dòng)脈整體及主動(dòng)脈竇進(jìn)行大體油紅O染色及蘇木素-伊紅(HE)染色，以觀察造模情況。造模成功后，治療組分別給予參紅通絡(luò)9、18、36 g/kg每日灌胃給藥，給予模型組、空白對(duì)照組小鼠等量生理鹽水灌胃，持續(xù)8 w后，小鼠禁食12 h，戊巴比妥腹腔注射麻醉后取小鼠主動(dòng)脈，剪下連有心臟的部分胸段主動(dòng)脈。

1.5檢測(cè)指標(biāo) ①大體油紅O染色觀察小鼠主動(dòng)脈整體的斑塊形成情況。將目的區(qū)域的血管分離，盡可能去除脂肪組織，組織經(jīng)過固定、剖開、染色后，鏡下觀察并拍照留存。結(jié)果判讀：脂滴呈橘紅色或鮮紅色。②HE染色觀察小鼠主動(dòng)脈竇的斑塊形成情況。取小鼠主動(dòng)脈使用生理鹽水浸洗，放入4%多聚甲醛，固定過夜，清洗，脫水，放入石蠟溶液中包埋，冷卻凝固后將蠟塊連續(xù)切取厚度4 μm的組織切片，然后依次進(jìn)行貼片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片后拍照留存。③免疫組化(IHC)法檢測(cè)CD86、CD206的表達(dá)水平。將石蠟切片使用檸檬酸鹽修復(fù)液95℃修復(fù)后，血清封閉，滴加一抗，4℃孵育過夜，滴加二抗，DAB顯色，各步驟間磷酸鹽緩沖液(PBS)4 min×5次充分洗滌，蘇木素復(fù)染6 min，脫水、透明、封片，使用顯微鏡觀察并拍照留存。④Western印跡法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈組織中iNOS、Arg-1蛋白的表達(dá)水平。提取組織蛋白并蛋白定量后，準(zhǔn)備電泳，轉(zhuǎn)膜，加脫脂牛奶，按說明書加一抗稀釋、加入三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水與補(bǔ)間(TBST)，將二抗稀釋、孵育，而后洗脫，全部完成后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，分析凝膠圖像，用Image-Pro Plus6.0軟件分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1參紅通絡(luò)方對(duì)小鼠主動(dòng)脈整體斑塊形成的影響 如圖1所示，可以觀察到空白對(duì)照組主動(dòng)脈整體無明顯斑塊的形成；模型組主動(dòng)脈整體有明顯紅色斑塊形成；與模型組相比，參紅通絡(luò)方低、中、高劑量組小鼠主動(dòng)脈整體紅色斑塊面積均有不同程度的減少。定量分析結(jié)果顯示，模型組主動(dòng)脈整體平均斑塊占比為(44.25±5.18)%，參紅通絡(luò)低、中、高劑量組主動(dòng)脈平均斑塊占比分別為(30.58±3.26)%、(24.61±4.13)% 和(28.59±1.72)%，與模型組比較顯著降低(P<0.05)；參紅通絡(luò)中劑量組主動(dòng)脈整體斑塊占比最低，與參紅通絡(luò)低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 各組主動(dòng)脈血管大體油紅O染色結(jié)果

2.2參紅通絡(luò)方對(duì)小鼠主動(dòng)脈根部斑塊形成的影響 如圖2，空白對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)壁邊緣整齊，結(jié)構(gòu)清晰，無斑塊；模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)壁可見明顯斑塊凸起，壞死核心形成。與模型組相比，參紅通絡(luò)方各劑量組均呈現(xiàn)不同程度的改善。定量分析結(jié)果顯示，模型組主動(dòng)脈竇斑塊占比達(dá)(55.13±9.81)%；參紅通絡(luò)低、中、高劑量組斑塊占比分別為(43.20±2.22)%、(31.08±5.25)%和(33.98±5.06)%，與模型組比較顯著降低(P<0.05)。

2.3參紅通絡(luò)方對(duì)CD86、CD206的表達(dá)水平的影響 如圖3，與空白對(duì)照組相比，模型組主動(dòng)脈組織中CD86含量顯著升高(P<0.01)，而CD206 含量明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，參紅通絡(luò)方低、中、高劑量組主動(dòng)脈組織中CD86含量均顯著降低(P<0.05)，而CD206含量均升高(P<0.05)。與參紅通絡(luò)方低劑量組相比，參紅通絡(luò)方中劑量組提高CD206表達(dá)水平的效果最佳，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3、表1。

圖2 各組主動(dòng)脈根部HE染色(×160)

圖3 各組主動(dòng)脈組織CD86、CD206表達(dá)(IHC，大圖×160，右下角圖×480)

表1 各組主動(dòng)脈組織CD86、CD206的表達(dá)情況

2.4參紅通絡(luò)對(duì)iNOS、Arg-1蛋白表達(dá)水平的影響 與空白對(duì)照組相比，模型組主動(dòng)脈組織中iNOS蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，而Arg-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，參紅通絡(luò)低、中、高劑量組主動(dòng)脈組織中iNOS蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，Arg-1蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)。參紅通絡(luò)中劑量組提高Arg-1蛋白表達(dá)水平的效果最好，與參紅通絡(luò)低劑量組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表2。

1～5:空白對(duì)照組，模型組，參紅通絡(luò)低劑量組，參紅通絡(luò)中劑量組，參紅通絡(luò)高劑量組圖4 各組主動(dòng)脈組織iNOS和Arg-1的蛋白表達(dá)

表2 各組主動(dòng)脈組織iNOS、Arg-1表達(dá)比較

3 討 論

中醫(yī)根據(jù)癥狀及體征把AS歸為“瘀證”“脈痹”“胸痹”等疾病范圍。中醫(yī)認(rèn)為AS是由很多因素造成，其主要成因與飲食不當(dāng)、情志失調(diào)、年老體弱、外邪侵襲等密切相關(guān)，其病機(jī)為氣、血、津液紊亂，臟腑功能失調(diào)而形成痰、飲、瘀、毒，多屬本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜之證，本虛為氣虛、陰虛、陽虛，標(biāo)實(shí)則為痰濁、血瘀、熱毒〔6〕。國醫(yī)大師任繼學(xué)教授認(rèn)為伏邪具有“邪伏虛處，待時(shí)而發(fā)，反復(fù)發(fā)作，不易去除”的特點(diǎn)，是慢性疾病的共同病因〔7〕，認(rèn)為“痰瘀伏絡(luò)”是AS的核心病機(jī)。因此，參紅通絡(luò)方由人參、丹參，紅景天、金銀花、赤芍、瓜蔞、當(dāng)歸、降香等8味中藥配伍組成，其中人參以健脾補(bǔ)肺，丹參以補(bǔ)血活血，紅景天以活血通絡(luò)，金銀花以清熱解毒，赤芍以行血活血，瓜蔞以清熱化痰，當(dāng)歸以祛瘀止痛，降香以緩急止痛，共同達(dá)到益氣化瘀、豁痰通絡(luò)解毒的功效。根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究，人參皂苷Rb〔8〕可促進(jìn)白細(xì)胞介素(IL)-4和IL-3的分泌，使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT)6發(fā)生磷酸化，促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化，從而發(fā)揮抗AS的作用，丹參酮ⅡA〔9〕能夠促使M2型細(xì)胞分泌抗炎因子,抑制M1型細(xì)胞分泌促炎因子,從而達(dá)到抗AS作用，紅景天苷〔10〕可能通過調(diào)節(jié)血脂代謝、調(diào)整巨噬細(xì)胞M1/M2分型極化達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定斑塊的作用，金銀花〔11〕主要的有效藥理成分是綠原酸，綠原酸通過抑制炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)堆積來發(fā)揮抗AS的作用，赤芍總苷〔12〕通過抑制心肌細(xì)胞凋亡、 清除氧自由基等作用來抗AS，瓜蔞〔13〕主要成分為皂苷及氨基酸，具有擴(kuò)張動(dòng)脈，營養(yǎng)心肌等作用，當(dāng)歸可以增加心肌細(xì)胞的血流量，抗血栓形成，抑制血小板聚集，降香〔14〕能夠調(diào)節(jié)脂肪酸氧化與糖代謝，維持心肌能量代謝平衡，從而保護(hù)心肌。

AS是臨床上一種累及大、中動(dòng)脈的炎癥性疾病。在AS血液循環(huán)中，單核細(xì)胞遷移到動(dòng)脈易損部位并黏附到活化的內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞間隙中，在局部產(chǎn)生趨化因子遷移到內(nèi)膜下層，轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，之后，一些炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表面表達(dá)清道夫受體，使巨噬細(xì)胞大量吞噬氧化修飾的脂蛋白形成泡沫細(xì)胞，脂質(zhì)負(fù)荷的泡沫細(xì)胞死亡，形成壞死脂質(zhì)核心，其上覆蓋平滑肌細(xì)胞分泌的基質(zhì)蛋白質(zhì)形成的纖維帽，形成AS斑塊〔15〕。本研究結(jié)果顯示，參紅通絡(luò)方能夠有效抑制主動(dòng)脈整體及主動(dòng)脈竇斑塊形成，有效減少脂質(zhì)堆積并減少膠原纖維的形成，抑制AS病變的進(jìn)展，達(dá)到抗AS的效果。

M1型巨噬細(xì)胞大部分是由脂多糖、干擾素γ等細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化，能夠高表達(dá)CD86、iNOS等，與斑塊發(fā)生、進(jìn)展及斑塊不穩(wěn)定息息相關(guān)。其主要原因?yàn)镸1型巨噬細(xì)胞能夠分泌多種促炎因子及促炎介質(zhì)，使內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)一氧化氮等活性氧的合成，進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激反應(yīng)，促使細(xì)胞凋亡，加快斑塊鈣化，進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)展。同時(shí)，M1型巨噬細(xì)胞還能夠釋放基質(zhì)金屬蛋白酶，使細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分解處于失衡狀態(tài)，明顯使斑塊內(nèi)纖維帽變薄，從而大大增加了斑塊的不穩(wěn)定性，甚至導(dǎo)致斑塊破裂，從而加速了心血管不良事件的發(fā)生，而由IL-4、IL-10等細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化的M2型巨噬細(xì)胞，高表達(dá)IL-1、IL-10、CD206、Arg-1等，具有吞噬、促血管生成及促進(jìn)組織修復(fù)，減少炎癥反應(yīng)，維持斑塊穩(wěn)定，進(jìn)而延緩AS的發(fā)生發(fā)展〔16，17〕。在AS不同階段，不同亞型的巨噬細(xì)胞比例一直處于動(dòng)態(tài)變化當(dāng)中。已有研究表明，在AS發(fā)展期，M1型和M2 型巨噬細(xì)胞的數(shù)量均增加，其中，M1型巨噬細(xì)胞主要在易損斑塊肩部聚集〔18〕，而M2 型巨噬細(xì)胞主要存在于穩(wěn)定的斑塊區(qū)域中〔19〕，在AS進(jìn)展期，斑塊以M1型為主，在AS消退期，斑塊以M2 型為主，因此，可以認(rèn)為當(dāng)斑塊處M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量超過M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量時(shí)，斑塊可能會(huì)更加穩(wěn)定，不容易發(fā)生斑塊破裂現(xiàn)象，從而延緩了AS的發(fā)展〔20〕。本研究證實(shí)了參紅通絡(luò)方能夠有效降低M1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)，提高M(jìn)2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)，改善巨噬細(xì)胞的極化比例，抑制血管內(nèi)炎癥反應(yīng)，明顯縮小斑塊面積，有效增加斑塊的穩(wěn)定性，進(jìn)而延緩AS進(jìn)程，達(dá)到抗AS的目的。

綜上所述，參紅通絡(luò)方通過減少M(fèi)1型促炎巨噬細(xì)胞的極化，增加M2型抗炎巨噬細(xì)胞極化，縮小斑塊面積，維持斑塊的穩(wěn)定性，進(jìn)而發(fā)揮抗AS的作用，進(jìn)一步為臨床研究該方提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但該方具體通過何種途徑干預(yù)巨噬細(xì)胞極化仍待深入研究。