生熟三七醇提物對腦缺血再灌注損傷小鼠的療效

朱蔚然 王潔 瞿領(lǐng)航 涂濟源 傅敏 王光忠，2 曹國勝，2

(1湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065；2湖北省中藥炮制工程技術(shù)研究中心)

目前腦卒中是危害人類生命安全和身體健康的重大疾病之一〔1〕，在老年人群體中發(fā)病率較高，并隨著我國老齡化的加速，發(fā)病率呈上升趨勢，其中缺血性腦卒中占比較大〔2，3〕。三七有活血散瘀、消腫定痛功效，是防治心腦血管相關(guān)疾病的常用中藥材〔4，5〕，研究表明，三七有抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗感染、改善缺血性腦組織損傷等作用〔6〕。在臨床上，三七可生熟兩用，但功效卻有顯著差異，《中藥大辭典》中三七生品活血化瘀、消腫止痛；經(jīng)過炮制后，熟三七有補氣補血、健體的功效〔7〕。三七在經(jīng)過炮制后主要藥效發(fā)生改變，可能與炮制前后三七主要藥理活性成分的變化有一定的關(guān)系。本研究旨在探討生熟三七醇提物對腦缺血再灌注損傷小鼠的療效。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1藥物 生三七粉的制備：40頭三七，洗凈，干燥，粉碎后過四號篩。熟三七粉的制備：40頭三七，加水浸泡3 h，在60℃，75%RH的條件下加30%的水潤制24 h，110℃蒸制3 h，切成約1 mm厚度的薄片，80℃干燥12 h，粉碎后過四號篩〔8〕。生熟三七醇提物的制備：稱取適量生熟三七藥粉，加10倍量的70%乙醇，水浴加熱，回流提取3次，每次2 h，過濾提取液，合并濾液，揮干乙醇，冷凍干燥成藥粉，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2動物 120只雄性C57BL/6小鼠，體重22～24 g，動物許可證號為SCXK(鄂)2017-0012，在實驗室環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)，3 d后進行實驗。

1.1.3試劑 三七皂苷R1對照品(批號：1114-0025，含量≥98.0%)、人參皂苷Rg1對照品(批號：0148-0025，含量≥98.5%)及人參皂苷Rb1對照品(批號：0149-0025，含量≥98.5%)均購自成都普思生物科技股份有限公司；氯化三苯基四氮唑(TTC，批號C10103901)購自上海麥克林生化科技有限公司；丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；無水乙醇和水合氯醛為AR級別，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇和乙腈為色譜純，購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

1.1.4儀器 Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀購自安捷倫科技(中國)有限公司；1730R高速冷凍離心機購自韓國Gene公司；Box998型酶標(biāo)儀購自美國BioTek儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1含量測定

1.2.1.1高效液相色譜法(HPLC)色譜條件 色譜柱：Agilent5HC-C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 ml/min；柱溫：20℃；檢測波長：203 nm；進樣體積：10 μl；流動相：流動相A為乙腈，流動相B為水；梯度洗脫〔9〕：0～12 min，19%流動相A；12～60 min，19%→36%流動相A。

1.2.1.2溶液配制 混合對照品溶液：分別精密稱取10 mg三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1對照品置于10 ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度。分別精密量取1 ml以上各對照品溶液置于同一10 ml容量瓶中，再加入甲醇稀釋至刻度。供試品溶液：分別精密稱取0.6 g生熟三七粉末，置于100 ml錐形瓶中，精密加入50 ml 70%甲醇溶液，稱重，于室溫下超聲45 min，放冷，再稱重，用70%甲醇溶液補重，搖勻，靜置，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液。使用高效液相色譜儀檢測三七中皂苷類成分含量。

1.2.2分組、給藥和動物模型的制備 對C57BL/6小鼠進行隨機分組：假手術(shù)組，模型組，生三七醇提物低劑量組(生低組，200 mg/kg)，生三七醇提物高劑量組(生高組，400 mg/kg)，熟三七醇提物低劑量組(熟低組，200 mg/kg)，熟三七醇提物高劑量組(熟高組，400 mg/kg)，分組后給藥組分別灌胃相應(yīng)劑量藥物，假手術(shù)組與模型組灌胃等量生理鹽水，每天灌胃1次，連續(xù)3 d。小鼠造模前禁食不禁水12 h，采用線栓法制備小鼠腦缺血再灌注(I/R)損傷模型〔10〕，假手術(shù)組同模型組方法進行處理，但不插入線栓。

1.2.3神經(jīng)功能評分 小鼠造模24 h后，參照Longa評分法〔11〕對各組神經(jīng)功能進行評分。將小鼠放置平臺上，行動正常，神經(jīng)功能無損傷：0分；右前肢不能完全伸展：1分；將小鼠放置平臺上，行走時會向右側(cè)(癱瘓側(cè))轉(zhuǎn)圈：2分；將小鼠放置平臺上，行走時會向右側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒：3分；將小鼠放置平臺上，不能自發(fā)行走，存在喪失意識現(xiàn)象：4分。

1.2.4TTC染色法測定腦梗死體積 小鼠造模24 h后，將小鼠處死后迅速取腦，于-20℃冰箱中冷凍20 min，切取腦片，切成5片，厚度為2 mm左右。將切片放置于培養(yǎng)皿中，倒入1%的TTC染液，避光的條件下37℃孵育30 min后，用4%多聚甲醛固定，24 h后取出染色后的腦片，排列，標(biāo)號，拍照并記錄，利用ImageJ圖像處理軟件計算腦梗死體積。

1.2.5腦組織中MDA和MPO含量檢測 小鼠造模24 h后，將小鼠處死后迅速取腦，-20℃冰箱中冷凍20 min，分離出缺血側(cè)大腦，制備腦組織勻漿，4 000 r/min離心10 min，吸取上清并放入-20℃冰箱，按各試劑盒說明書來檢測各生化指標(biāo)。

1.2.6腦組織蘇木素-伊紅(HE)染色 小鼠造模24 h后，將小鼠處死后迅速取腦，4%多聚甲醛溶液固定24 h，脫水，石蠟包埋，5 μm切片，脫蠟至水，HE染色，脫水，中性樹脂封固，于顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1三七炮制前后活性成分變化 生三七中三七皂苷R1含量為1.1%，人參皂苷Rg1含量為5.1%，人參皂苷Rb1含量為5.7%，而熟三七中三七皂苷R1含量為0.6%，人參皂苷Rg1含量為3.5%，人參皂苷Rb1含量為2.8%。表明三七在炮制過后，三七皂苷R1，人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1含量顯著降低。見圖1。

圖1 對照品及生熟三七樣品HPLC圖譜

2.2生熟三七醇提物對腦I/R損傷小鼠神經(jīng)功能評分的影響 與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)功能評分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，生低組、生高組、熟高組神經(jīng)功能評分均顯著降低(均P<0.05)。見表1。

2.3生熟三七醇提物對腦I/R損傷小鼠腦組織MDA和MPO含量的影響 與假手術(shù)組相比，模型組損傷小鼠腦組織MDA和MPO含量顯著升高(P<0.05)；相較于模型組，生低組、生高組、熟低組、熟高組腦組織MDA含量均顯著下降(P<0.05)，生高組MPO含量顯著下降(P<0.05)。見表2。

表1 生熟三七醇提物對腦I/R損傷小鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死體積的影響

表2 生熟三七醇提物對腦I/R損傷小鼠MDA和MPO含量的影響

2.4生熟三七醇提物對腦I/R損傷小鼠腦梗死體積的影響 與假手術(shù)組相比，模型組腦梗死體積顯著增大(P<0.05)；與模型組相比，生低組、生高組、熟低組、熟高組腦梗死體積顯著減小(P<0.05)。見表1、圖2。

2.5生熟三七醇提物對腦I/R損傷小鼠腦組織形態(tài)的影響 假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞形態(tài)正常，神經(jīng)元排列整齊；模型組腦組織結(jié)構(gòu)較為疏松，細(xì)胞間隙增大，大量細(xì)胞凋亡；在給藥干預(yù)后，生低組、生高組、熟低組、熟高組腦組織損傷形態(tài)均有所改善，其中生高組改善作用最明顯。見圖3。

圖2 各組腦梗死TCC染色

圖3 各組腦組織HE染色(×200)

3 討 論

缺血性腦卒中是指由于腦血管阻塞導(dǎo)致血液不能流入大腦而引起腦組織受損的一類疾病〔12〕，若能及時溶栓治療，恢復(fù)腦部血流供應(yīng)，可減輕神經(jīng)功能損傷，而在腦缺血一定時間后血流恢復(fù)，腦組織損傷不僅不會減輕，反而會進一步加重，稱為腦缺血再灌注損傷〔13，14〕。缺血性腦卒中的病理機制十分復(fù)雜，會引發(fā)自由基損傷，炎癥反應(yīng)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡等級聯(lián)反應(yīng)〔15，16〕。臨床上三七已經(jīng)廣泛應(yīng)用于防治缺血性腦卒中，研究表明，三七中皂苷類成分對腦血管相關(guān)疾病有保護作用〔17〕。

三七中主要藥理活性成分包括三七皂苷R1，人參皂苷Rg1、Rb1、Re等多種皂苷類成分〔18，19〕。生三七蒸制為熟三七后，通過高效液相色譜法測定含量，發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1含量均有所下降，原因是在蒸制過程中，高溫使得三七中皂苷類成分的糖苷鍵發(fā)生裂解，脫掉部分糖基，會轉(zhuǎn)化成含糖基較少的皂苷〔20〕。

神經(jīng)功能損傷評分及腦梗死體積可反映腦缺血再灌注損傷的程度。脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，其含量高低可反映出腦細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的程度〔21〕；在腦缺血再灌注發(fā)生后，MPO會催化反應(yīng)生成大量氧化劑，導(dǎo)致氧化性腦組織損傷〔22〕。

本研究結(jié)果表明，生三七抗缺血性腦損傷的作用優(yōu)于熟三七，可能與三七在炮制后其主要活性成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1含量的減少有關(guān)，不過這一假設(shè)需后續(xù)研究驗證。