重癥肌無力生物信息學靶點篩選及驗證

鐘斯然 張帆 夏星 李寶銅 彭詩鋼 溫玉琴 丘芬

(廣西中醫(yī)藥大學 1藥學院,廣西 南寧 530299;2中藥藥理重點實驗室)

重癥肌無力(MG)主要指的是由乙酰膽堿受體抗體介導的自身免疫疾病。其發(fā)病原理乙酰膽堿能運動神經(jīng)元與肌肉的突觸產(chǎn)生病變〔1，2〕。臨床表現(xiàn)是波動性四肢骨骼肌疲勞〔3〕，并可累及咽喉肌或眼外肌，表現(xiàn)為眼瞼下垂、視力模糊、表情淡漠、抬頭飲水困難、聳肩無力、上樓梯、下蹲及抬臂困難等，據(jù)估計，MG患者75%以上有胸腺增生，嚴重影響患者的正常生活和身體健康。由于MG的發(fā)病原因不明，目前尚無特效療法。

生物信息學是以計算機為工具，對生命科學研究中的生物信息進行存儲、檢索和分析的科學。這門新學科開辟了疾病研究的新途徑。本文通過探討MG相關(guān)的mRNAs表達的改變，為MG的診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)收集預處理和差異表達分析 胸腺基因芯片原始數(shù)據(jù)收集于GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)，芯片數(shù)據(jù)的編號為GSE11967，芯片平臺為GPL5175 〔HuEx-1_0-st〕 Affymetrix Human Exon 1.0 ST Array 〔transcript (gene) version〕。芯片的樣本來源于MG患者胸腺和正常胸腺，分為對照組和MG組各2例。下載的原始數(shù)據(jù)通過R語言Affy程序包〔4〕進行數(shù)據(jù)預處理，包括扣除背景，標準化數(shù)據(jù)，標注探針，構(gòu)建表達矩陣；通過主成分分析(PCA)和t-分布域嵌入算法(t-sne)的質(zhì)控分析，探討各組間和組內(nèi)的異質(zhì)性和同質(zhì)性，并進行質(zhì)控和分析。最后，使用limma〔5〕程序包分析正常樣本和MG樣本mRNA表達差異。同時繪制火山圖和熱圖，過濾探針注釋信息不全，極低表達和重復的基因，其中差異mRNA的篩選條件為FDR<0.01，LogFC >|2|。

1.2基因功能與信號通路的富集分析 基因本體數(shù)據(jù)庫(Gene ontology，GO，http：//geneontology.org/)〔6〕是一個在生物信息學領(lǐng)域中廣泛使用的基因注釋數(shù)據(jù)庫，提供一系列的語義用來描述基因、基因產(chǎn)物的特性。京都基因與基因組百科全書(KEGG，https：//www.kegg.jp/)〔7〕是大型分子數(shù)據(jù)集產(chǎn)成的基因組測序等高通量實驗技術(shù)應用的數(shù)據(jù)庫資源。

使用R語言clusterProfiler程序包〔8～10〕和相關(guān)的捆綁數(shù)據(jù)軟件包，選取差異表達基因進行GO和KEGG富集分析。通過繪制基因富集功能網(wǎng)絡(luò)圖探究：哪些富集的功能或通路與哪些基因相關(guān)；哪些基因同時參與哪個生物學功能或途徑；富集的功能或途徑之間有什么關(guān)系。

1.3蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析 STRING數(shù)據(jù)庫〔11〕(https：//string-db.org/)，選取差異表達基因，獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)信息，對胸腺差異表達基因構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過Cytoscape軟件及插件MCEODE、cytohubba，對網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，篩選網(wǎng)絡(luò)中核心基因。

1.4核心基因的驗證

1.4.1動物 C57BL/6小鼠，SPF級，雌性，體重18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK(湘)2016-0002，實驗動物質(zhì)量合格證號：43004700046105。

1.4.2試劑 人工合成鼠源性乙酰膽堿α亞基97-116 肽(Rα97-116)購自吉爾生化(上海)有限公司，批號P180509-DG148487；不完全弗氏佐劑(IFA)、完全弗氏佐劑(CFA)購自Sigma，批號分別為SLBV6904、SLBW1457；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Biological Industries，批號0012918；小鼠抗乙酰膽堿脂酶受體抗體(AchR-Ab)試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司，批號2018-9。

1.4.3儀器 UW620H型 電子天平(感量：0.01 g)，日本Shimadzu公司；TGL-20M型低溫高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HVA-110型高壓滅菌器，日本Hirayama公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Infinite200pro型酶標儀，Tecan奧地利有限公司。

1.4.4造模 取87只C57BL/6小鼠，12只作為空白組，其余小鼠復制MG模型作為模型組〔12〕。首次免疫于小鼠雙肩及雙后足底部共4個部位皮下注射50 μl/部位，正常組注射生理鹽水，其余小鼠注射Rα97-116/CFA混合液(Rα97-116：PBS液：CFA=1 mg∶2 ml∶2 ml)；首次免疫后第30天和第50天，采用同一配比的Rα97-116/IFA混合液于上述4個部位注射50 μl/酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定部位強化免疫。末次免疫后20 d，每只小鼠眼眶后靜脈叢取血0.3 ml，3 000 r/min分離血清，測定血清AChR-Ab水平，(樣品血清OD值/空白組血清OD值>2.1視為AChR-Ab陽性)。

1.4.5模型篩選

1.4.5.1行為學觀察 采用lennon分級〔13〕，分為4級：0級，無肌無力表現(xiàn)；1級，撕咬無力，小鼠運動減少；2級，明顯無力，低頭垂尾，協(xié)調(diào)性下降；3級，肌無力表現(xiàn)嚴重瀕臨死亡；4級，死亡。癥狀兩者之間為0.5、1.5、2.5、3.5分，評分≥1分為造模成功。

1.4.5.2新斯的明實驗 每只小鼠注射適量新斯的明和阿托品〔14〕，如果癥狀改善維持一段時間，評分降低證明該小鼠新斯的明實驗陽性。

1.4.5.3RNS電刺激實驗 BL420系統(tǒng)觀察腓腸肌肌電波幅有無衰減〔15〕，第4個波幅比第1個衰減率>10%為陽性,>20%為強陽性。同時滿足AChR-Ab陽性，即P/N值>2.1，P/N=(供試樣品OD值-空白孔OD值)/(陰性對照孔OD值-空白孔OD值)、肌力癥狀學評分≥1分、新斯的明實驗陽性、RNS電刺激第4個波幅比第1個衰減率>10%，則表明造模成功。

1.4.6實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測核心基因表達 末次藥后，禁食不禁水12～16 h，眼眶后靜脈叢取血，3 000 r/min分離血清，取胸腺-80℃凍存，RT-qPCR檢測CCL19、BGN基因表達。

2 結(jié) 果

2.1樣本數(shù)據(jù)的降維分析 使用PCA和t-sne對GSE11967表達矩陣在樣本的維度進行降維及可視化分析，圖1中一個點代表一個樣本，該樣本組內(nèi)差異很小，組間差異較大，兩種樣本的基因表達異質(zhì)性較大。表明芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可以用于下游分析。

圖1 GSE11967樣本的PCA降維分析、t-sne降維分析

2.2MG差異表達mRNA篩選和富集分析 對芯片數(shù)據(jù)用limma進行差異分析后，篩選出85個差異表達基因，利用R繪制火山圖和熱圖后發(fā)現(xiàn)33個上調(diào)，52個下調(diào)。見圖2和圖3。

2.3GO和KEGG富集分析 圖4可以看出BGN、CTGF等基因富集于細胞外基質(zhì)組織、分支上皮的形態(tài)發(fā)生通路。圖5可以看出CX3CR1、CXCLL11、CCL19基因與細胞因子-細胞因子受體相互用相關(guān)。CX3CR1、CXCL11、CCL19基因與病毒蛋白質(zhì)和細胞活素-細胞活素受體相互作用相關(guān)。

圖2 差異mRNA表達火山圖

圖3 差異mRNA表達熱圖

圖4 GO富集分析及GO功能與富集基因的聯(lián)系(網(wǎng)絡(luò)連線的顏色代表GO分析)

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)分析 通過Cytoscape及其插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，首先對胸腺組織差異表達基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，使用MCODE篩選核心的子網(wǎng)絡(luò)，其中發(fā)現(xiàn)CXCL11、CCL19、CHRM4、CX3CR1、HCAR1構(gòu)成子網(wǎng)絡(luò)。見圖6。使用CytoHubba進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，MCC前十個基因包括BGN、CCL19、CTGF、COL1A2、 FBLN1、CDH11、CXCL11、HCAR1、CHRM4、CX3CR1。

圖6 差異表達基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)MCODE score(顏色由深到淺表明評分高到低)

2.5動物實驗驗證結(jié)果

2.5.1模型篩選 空白組lennon評分〔(2.1±0.55)分〕顯著高于模型組〔(0.0±0.00)分，P<0.01〕；空白組Achr-Ab水平〔(123.49±23.74)pg/ml〕顯著低于模型組〔(373.40±69.19)pg/ml，P<0.01〕；模型組新斯的明給藥后小鼠癥狀評分〔(1.5±0.58)分〕顯著低于給藥前〔(2.1±0.58)分，P<0.01〕。肌電圖顯示模型組第4個波幅比第1個波幅下降率>10%，表示造模成功。見圖7。

2.5.2BGN、CCL19在小鼠胸腺中表達 與空白組比較，模型組BGN表達水平顯著上調(diào)，而CCL19表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)。見表1。

圖7 兩組肌電圖

表1 RT-qPCR檢測BGN、CCL19表達

3 討 論

BGN是富含小分子亮氨酸的蛋白聚糖(SLRPs) 家族成員之一，由2條糖胺聚糖側(cè)鏈和一個核心蛋白組成。其核心蛋白分子量約42 kD，含12個亮氨酸重復單位。BGN廣泛分布在骨、軟骨、肌腱、纖維組織等多種細胞外基質(zhì)組織中，是細胞外基質(zhì)的重要成分，現(xiàn)已被證明是參與炎癥反應的關(guān)鍵分子。在急性和慢性炎癥中，BGN均能促進白細胞介素(IL)-1β的分泌〔16〕。研究表明，隨著炎癥的增強，BGN高表達并伴隨著嚴重的組織損傷。而且，無論是在病原體誘導〔17〕還是無菌條件下BGN的缺乏均能減少炎癥反應〔18〕。

趨化因子是一組小分子量的蛋白質(zhì)家族成員，可以調(diào)控白細胞在炎癥部位募集，并且具有穩(wěn)定淋巴細胞環(huán)境的功能，趨化因子CCL19可能在正常淋巴細胞循環(huán)和歸巢中發(fā)揮作用。它在胸腺T細胞的運輸，T細胞和B細胞向次級淋巴器官的遷移中也起著重要作用。