原發(fā)性老年肝癌患者TACE前后miR-145、CD44變化及近期療效

王朝英 徐軍 羅靖茹 林海鋒

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，海南 海口 570311)

原發(fā)性肝癌(PHC)是由肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞發(fā)生的癌腫，病死率較高，是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一〔1〕。目前肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)是臨床上PHC中晚期患者，尤其是年老體弱無法耐受手術(shù)患者的首選治療方法，該法可阻斷腫瘤的血供，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的〔2〕。但腫瘤在TACE術(shù)后短期內(nèi)的復(fù)發(fā)率較高，同時(shí)化療藥物和栓塞劑造成的血供不足會(huì)損傷患者的正常組織，并使肝纖維化程度增加，預(yù)后較差〔3〕。因此尋求安全有效的生物標(biāo)志物對(duì)老年P(guān)HC患者TACE近期療效進(jìn)行預(yù)測(cè)，有利于臨床針對(duì)患者病情情況展開進(jìn)一步治療。近年來研究〔4，5〕發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、組織分化等密切相關(guān)，其中miR-145在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)miR-145可能對(duì)CD44的表達(dá)有調(diào)控作用，從而影響CD44陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞增殖。CD44是存在于多種細(xì)胞膜上的一種跨膜蛋白，作為腫瘤標(biāo)志物之一，CD44與人類癌癥及淋巴瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)，且CD44表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞特征〔6〕。但目前miR-145、CD44在預(yù)測(cè)老年P(guān)HC患者TACE近期療效方面的相關(guān)研究較少，故本研究通過分析TACE術(shù)前、術(shù)后老年P(guān)HC患者miR-145、CD44的表達(dá)情況，探討了miR-145、CD44對(duì)TACE近期療效的預(yù)測(cè)作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年2月至2021年5月于海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院接受TACE治療的老年P(guān)HC患者110例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①PHC符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》〔7〕中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)影像學(xué)檢查、病理檢查確診；②既往無手術(shù)、放化療、消融等治療史，且首次行TACE；③肝功能Child-Pugh分級(jí)〔8〕為A、B級(jí)；④預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月；⑤美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)體力狀況評(píng)分〔9〕0～2分；⑥患者及其家屬均已簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并TACE禁忌證，包括明顯腹水、肝癌體積>肝臟的70%、凝血功能障礙、門靜脈高壓伴中度以上胃底食管靜脈曲張、碘過敏、動(dòng)脈硬化、完全門靜脈癌栓阻塞、嚴(yán)重肝硬化門靜脈高；②無法完成選擇性肝動(dòng)脈插管者；③合并其他部位惡性腫瘤者或已發(fā)生淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；④合并代謝性疾病或心、肝、腎功能不全等嚴(yán)重器質(zhì)性疾病。本研究在實(shí)施前已獲得醫(yī)院倫理批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1TACE治療方法 患者取仰臥位，局部消毒麻醉后，采用Seldinger技術(shù)經(jīng)皮穿刺股動(dòng)脈(穿刺點(diǎn)為腹股溝韌帶下1.0～1.5 cm股動(dòng)脈搏動(dòng)明顯處)，以診斷性肝動(dòng)脈造影明確腫瘤位置、數(shù)量、直徑及供血情況，置入導(dǎo)管鞘，在X線透視及減影血管造影(DSA)造影的引導(dǎo)下，以導(dǎo)絲導(dǎo)管法選擇性插管至腫瘤的供血?jiǎng)用}?；熕幬锱c適量超液化碘油(≤20 ml)充分混合后作為栓塞劑經(jīng)導(dǎo)管緩慢注入，注射藥物時(shí)間≥20 min，最后退出導(dǎo)管，局部加壓包扎止血。術(shù)后進(jìn)行常規(guī)鎮(zhèn)痛、保肝、止吐、預(yù)防感染等治療。

1.2.2miR-145的檢測(cè) 采集患者TACE術(shù)前及術(shù)后3 d凌晨外周空腹肘靜脈血3～5 ml，經(jīng)3 000 r/min、4℃離心10 min后收集上層血清2 ml，加入Trizol總RNA提取劑(RNA快速提取試劑盒購(gòu)自杭州昊鑫生物科技股份有限公司)，震蕩混勻后室溫靜置5 min，加入0.2 ml氯仿，震蕩?kù)o置后離心15 min，吸取上清至滅菌離心管中，加入0.5 ml異丙醇離心10 min，去上清，加入75%乙醇1 ml，混勻后離心5 min，去上清，空氣干燥5～10 min，加入焦碳酸二乙酯水20 μl，混勻后分裝，于-80℃冰箱保存待測(cè)。采用一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)將樣本總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(RT-PCR試劑盒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，設(shè)計(jì)U6為內(nèi)參基因(上海恒斐生物科技有限公司)，miR-145上游引物序列：5′-GCCATTAGCGCCAATTGGCAAT-3′，下游：5′-CTTAGGAATTTCCGAATCTGCC-3′；U6上游：5′-TGGCCATGGGTCTTCATAACTG-3′，下游：5′-GGCAATCCTAAGCGTTACCGA-3′。以實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)miR-145，總反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性11 s，60℃退火28 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-145的相對(duì)表達(dá)量以ΔCt值表示，ΔCt=CtmiR-145-CtU6。

1.2.3CD44的檢測(cè) 采集患者TACE術(shù)前及術(shù)后3 d凌晨外周抗凝血2 ml，加等體積的0.9% NaCl溶液稀釋，將稀釋血液平鋪到3 ml淋巴細(xì)胞分離液上，兩液界面清晰，室溫下離心(800 r/min)30 min后明顯分層，吸取淋巴細(xì)胞層至潔凈離心管，以0.9% NaCl溶液洗滌重懸后離心(250 r/min)10 min，棄上清，加10 ml細(xì)胞緩沖液，離心(350 r/min)5 min后棄上清液。計(jì)數(shù)活細(xì)胞以1×106個(gè)/ml重懸于細(xì)胞染色緩沖液中，于細(xì)胞體系內(nèi)加入5 μl CD44-APC綴合抗體(美國(guó)Biolegend公司)，避光冰上15 min，離心(350 r/min)5 min，以2 ml細(xì)胞緩沖液洗滌2次。FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)Bector Dickinson公司)采集1×104個(gè)細(xì)胞，計(jì)算CD44陽(yáng)性細(xì)胞比率。CD44陽(yáng)性細(xì)胞(%)=(管內(nèi)CD44陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)-對(duì)照抗體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù))/10 000個(gè)腫瘤細(xì)胞×100%。

1.2.4療效評(píng)價(jià)及分組〔10〕TACE治療后3個(gè)月，根據(jù)改良實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(mRECIST)評(píng)估肝癌療效，完全緩解(CR)：所有目標(biāo)病灶動(dòng)脈期無增強(qiáng)顯影；部分緩解(PR)：目標(biāo)病灶(動(dòng)脈期增強(qiáng)顯影)的直徑總和縮小≥30%；進(jìn)展(PD)：目標(biāo)病灶(動(dòng)脈期增強(qiáng)顯影)的直徑總和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶；穩(wěn)定(SD)：目標(biāo)病灶的直徑縮小總和未達(dá)PR或增加未達(dá)PD；客觀緩解率(ORR)=(CR+PR)/總例數(shù)；臨床獲益率(CBR)=(CR+PR+SD)/總例數(shù)×100%。將CR、PR、SD患者納入療效良好組，PD患者納入療效不良組。

1.2.5收集可能影響TACE近期療效的相關(guān)因素 收集患者的臨床資料，包括性別、年齡、ECOG評(píng)分、Child-Pugh分級(jí)、臨床分期〔11〕、乙型肝炎E抗原(HbeAg)狀態(tài)、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、包膜完整性、超選擇栓塞腫瘤供血支、門靜脈癌栓、術(shù)中碘油用量、聯(lián)合治療方案(消融、放療、分子靶向藥物治療)、化療藥物(5-氟尿嘧啶、表阿霉素、絲裂霉素)血清甲胎蛋白(AFP)水平、血清miR-145相對(duì)表達(dá)量、CD44陽(yáng)性細(xì)胞比率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)、Logistic回歸分析，并繪制受試者工作特征(ROC)曲線，評(píng)估m(xù)iR-145、CD44對(duì)老年P(guān)HC患者TACE近期療效的預(yù)測(cè)效能，計(jì)算曲線下面積(AUC)值。

2 結(jié) 果

2.1TACE術(shù)前后miR-145、CD44的表達(dá)情況 與TACE術(shù)前比較，TACE術(shù)后患者miR-145相對(duì)表達(dá)量明顯升高，CD44陽(yáng)性細(xì)胞比率明顯降低(均P<0.001)。見表1。

2.2TACE術(shù)后3個(gè)月的近期療效 首次治療3個(gè)月后，110例患者中CR 3例(2.73%)，PR 61例(55.45%)，PD 22例(20.00%)，SD 24例(21.82%)，ORR為58.18%(64/110)，CBR為80.00%(88/110)；療效良好組88例，療效不良組22例。

表1 TACE術(shù)前、術(shù)后miR-145、CD44的表達(dá)

2.3單因素分析可能影響患者TACE術(shù)后近期療效的相關(guān)因素 與療效良好組比較，療效不良組包膜不完整、未超選擇栓塞供血支、門靜脈癌栓占比、腫瘤直徑及TACE術(shù)后CD44陽(yáng)性細(xì)胞比率明顯升高，療效不良組TACE術(shù)后miR-145相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 可能影響患者TACE術(shù)后近期療效的相關(guān)因素〔n(%)〕

2.4Logistic回歸分析影響患者術(shù)后近期療效的相關(guān)因素 TACE術(shù)后CD44陽(yáng)性細(xì)胞比率、未超選擇栓塞供血支及門靜脈癌栓是影響老年P(guān)HC患者TACE近期療效的危險(xiǎn)因素，TACE術(shù)后miR-145相對(duì)表達(dá)量是影響老年P(guān)HC患者TACE近期療效的保護(hù)因素(P<0.05)。見表3。

2.5ROC分析miR-145、CD44對(duì)老年P(guān)HC患者TACE近期療效的預(yù)測(cè)作用 miR-145聯(lián)合CD44預(yù)測(cè)老年P(guān)HC患者TACE近期療效的靈敏度、準(zhǔn)確度均高于miR-145、CD44單獨(dú)預(yù)測(cè)。見表4、圖1。

表3 Logistic回歸分析影響患者術(shù)后近期療效的相關(guān)因素

表4 ROC分析miR-145、CD44對(duì)老年P(guān)HC患者TACE近期療效的預(yù)測(cè)作用

圖1 miR-145、CD44預(yù)測(cè)老年P(guān)HC患者TACE近期療效的ROC曲線

3 討 論

目前臨床上治療PHC的非手術(shù)方法主要包括TACE術(shù)、放化療、射頻消融、微波等，其中TACE術(shù)以其療效佳、耐受性高的特點(diǎn)被中晚期PHC患者尤其是老年患者所接受，廣泛應(yīng)用于PHC的治療中〔12〕。TACE術(shù)主要通過栓塞腫瘤的供血?jiǎng)用}，使腫瘤組織缺血壞死，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，但化療栓塞后腫瘤易形成新的側(cè)支循環(huán)，短期內(nèi)易復(fù)發(fā)，影響臨床療效和轉(zhuǎn)歸，同時(shí)肝臟正常組織可由于栓塞劑和化療藥物的沉積而發(fā)生損傷，導(dǎo)致肝功能受損〔13，14〕。故此，采用合適的標(biāo)志物預(yù)測(cè)老年P(guān)HC患者TACE術(shù)的近期療效是臨床治療PHC的重點(diǎn)。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，miRNA的多種生物學(xué)功能被逐漸發(fā)掘，其可通過調(diào)控細(xì)胞分化和凋亡直接參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)miRNA在腫瘤中可以發(fā)揮促癌基因或抑癌基因的作用〔15〕。有研究〔16〕發(fā)現(xiàn)，miR-145在結(jié)直腸癌、肺癌、食管癌等多種腫瘤組織中存在差異性表達(dá)，且外周血miR-145的表達(dá)量與食管癌的近期療效呈正相關(guān)。Zeng等〔17〕通過研究miR-145在胃癌中的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，miR-145可靶向調(diào)控CD44的3′-非翻譯區(qū)，從而在抑制腫瘤生長(zhǎng)和化療耐藥中起關(guān)鍵作用。近年來研究〔18〕發(fā)現(xiàn)，CD44在人類惡性腫瘤組織中普遍存在，人類CD44基因位于11號(hào)染色體短臂，其作為跨膜蛋白可與胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸、膠原、層黏連蛋白等基質(zhì)分子結(jié)合，參與腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞和宿主基質(zhì)的黏附，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。胡榆雪等〔19〕一項(xiàng)薈萃分析提示，CD44陽(yáng)性表達(dá)與肝癌患者預(yù)后密切相關(guān)。

本研究說明老年P(guān)HC患者TACE療效較好，TACE術(shù)前、術(shù)后miR-145與CD44均有顯著變化。邢愛麗等〔20〕分析影響大肝癌患者TACE療效的相關(guān)因素發(fā)現(xiàn)，合并門靜脈癌栓、腫瘤包膜不完整及腫瘤位于危險(xiǎn)部位是影響治療效果的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究Logistic回歸分析結(jié)果表明TACE中未超選擇栓塞供血支、存在門靜脈癌栓及CD44陽(yáng)性細(xì)胞比率高的患者，近期療效較差，而miR-145相對(duì)表達(dá)量較高的患者，近期療效較好。此外，ROC分析結(jié)果提示miR-145、CD44在老年P(guān)HC患者TACE近期療效的預(yù)測(cè)中有重要意義，二者聯(lián)合檢測(cè)可作為臨床預(yù)測(cè)TACE近期療效的指標(biāo)。