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    TFF1在食管癌中表達(dá)及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

    2022-07-30 03:35:14李亞光鄧同興宋德志李曉龍
    中國(guó)老年學(xué)雜志 2022年14期
    關(guān)鍵詞:食管癌癌癥胃癌

    李亞光 鄧同興 宋德志 李曉龍

    (1漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?;A(chǔ)醫(yī)學(xué)部,河南 漯河 462000;2廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

    食管癌(ESCA)是全球第七大常見(jiàn)癌癥,死亡率居第六位〔1〕。ESCA可分為食管鱗癌(ESCC)和腺癌(EAC)〔2〕。ESCC在亞洲較為常見(jiàn),占ESCA 90%以上,EAC發(fā)生在歐美國(guó)家〔3〕。中國(guó)是ESCA的高發(fā)國(guó)家,主要是ESCC。此外,ESCC在中國(guó)大陸的癌癥發(fā)病率排名第五,死亡率排名第四〔4〕。ESCA作為惡性腫瘤的主要組織病理學(xué)表現(xiàn)形式,是一種低生存率的致命性惡性腫瘤〔5〕。盡管有先進(jìn)的診斷和治療方法,但大多數(shù)病例診斷為晚期,由于轉(zhuǎn)移迅速,預(yù)后較差〔6〕。各種研究報(bào)道,超過(guò)50%的患者在早期診斷時(shí)就開(kāi)始轉(zhuǎn)移。根據(jù)轉(zhuǎn)移的分期,惡性腫瘤可分為局部轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。此外,已確定遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移階段可導(dǎo)致約50%的惡性腫瘤患者死亡〔7〕。ESCA 5年總生存率低于15%〔4,8〕。ESCA患者由于診斷晚、治療反應(yīng)差導(dǎo)致預(yù)后差〔9,10〕。三葉因子家族(TFF)由胃多肽(pS2)/TFF1、解痙肽(SP)/TFF2、腸三葉因子(ITF)/TFF3三種分泌肽組成。TFFs在胃腸道中大量表達(dá),保護(hù)黏膜上皮細(xì)胞免受各種損傷,促進(jìn)上皮細(xì)胞〔11〕的連續(xù)性;然而,它們根據(jù)表達(dá)〔12〕組織的病理生理狀態(tài)表現(xiàn)出不同的作用。由于TFF1在腫瘤中表達(dá)量和腫瘤發(fā)生環(huán)境不同,其在腫瘤中的作用仍存在爭(zhēng)議。TFF1最初在乳腺癌細(xì)胞〔13〕中被發(fā)現(xiàn),TFF1被認(rèn)為是一種致癌基因〔14,15〕,是激素治療陽(yáng)性反應(yīng)的預(yù)測(cè)因子〔16,17〕。在不同的腫瘤組織(結(jié)腸癌,胰腺和卵巢),與正常組織相比,TFF1與刺激細(xì)胞存活、遷移、侵襲性和腫瘤擴(kuò)散相關(guān)〔18~20〕。由于TFF1缺乏的小鼠會(huì)發(fā)展成抗幽門腺瘤,30%進(jìn)展為胃癌〔21〕。本研究旨在探討TFF1在ESCA中表達(dá)及其潛在的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

    1 實(shí)驗(yàn)方法

    1.1Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析 在Oncomine4.5數(shù)據(jù)庫(kù)中分析ESCA中TFF1的mRNA表達(dá)。Oncomine(www.oncomine.org)是目前世界上最大的致癌基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)和綜合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái),包含715個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集和來(lái)自86 733個(gè)癌癥組織和正常組織〔22〕的數(shù)據(jù)。本研究從Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得TFF1在不同癌組織及其相鄰正常對(duì)照樣本之間的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本分析并借鑒了一系列ESCA研究,包括Kim食管癌、Kimchi食管癌、Hao 食管癌研究。并分析了TFF1在食管癌組織中相對(duì)于其在正常組織中表達(dá)情況。采用t檢驗(yàn)比較轉(zhuǎn)錄表達(dá)的差異。P值的常用值和差異倍數(shù)如下:P<0.01,差異倍數(shù):1.5,基因排列:10%,數(shù)據(jù)類型:mRNA。

    1.2GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析 利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)研究食管癌腫瘤組織與正常組織間TFF1的表達(dá)情況。GEPIA 是一種基于腫瘤基因組圖譜(TCGA)和基因型組織表達(dá)(GTEx)項(xiàng)目的在線mRNA表達(dá)評(píng)估工具〔23〕。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了箱形圖和腫瘤分期圖分析,當(dāng)P<0.01時(shí),認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    1.3cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析 cBioPortal(http://cbioportal.org)是一個(gè)開(kāi)放獲取的資源,用于探索、可視化和分析多維癌癥基因組數(shù)據(jù),目前包含225項(xiàng)癌癥研究。我們用cBioPortal分析了TCGA ESCA樣品中TFF1的變化。搜索參數(shù)包括突變和mRNA表達(dá)。OncoPrint選項(xiàng)卡顯示TFF1中每個(gè)樣本的遺傳突變概況。并網(wǎng)絡(luò)可視化了來(lái)自公共通路數(shù)據(jù)庫(kù)的TFF1的生物相互作用網(wǎng)絡(luò),使用基于每個(gè)基因組改變頻率的顏色編碼和篩選選項(xiàng)。其中包括改變頻率較大的鄰近基因。以Kaplan-Meier圖顯示ESCA患者TFF1基因突變及其與OS的相關(guān)性,并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn),判斷生存曲線差異的意義。

    1.4Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)分析 Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.linkes.org/ login.php)是一個(gè)基于web的平臺(tái),用于分析32個(gè)TCGA癌癥相關(guān)多維數(shù)據(jù)集〔24〕。采用Linked Omics的Link Finder模塊研究TCGA ESCA隊(duì)列中與TFF1相關(guān)的差異表達(dá)基因,結(jié)果采用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有的結(jié)果都在火山圖、熱圖或散點(diǎn)圖中以圖形形式呈現(xiàn)出來(lái)。Linked Omics的Link-Interpreter模塊對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行通路和網(wǎng)絡(luò)分析。應(yīng)用基于Web的Web Gestalt中的綜合功能分類數(shù)據(jù)庫(kù)〔25〕,對(duì)Link Finder結(jié)果中的數(shù)據(jù)進(jìn)行簽名和排序,使用GSEA對(duì)GO〔細(xì)胞組分(CC)、通路分析(BP)、分子功能(MF)〕、KEGG通路進(jìn)行分析。

    2 結(jié) 果

    2.1TFF1在不同癌癥中的mRNA表達(dá)情況 首先,分析TFF1在不同腫瘤組織中的mRNA表達(dá)情況。Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)的主要功能是基因表達(dá)差異分析、基因表達(dá)與臨床相關(guān)性分析及多基因共表達(dá)分析。利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)TFF1 mRNA在不同腫瘤和正常臨床標(biāo)本中的表達(dá)。最終,650個(gè)數(shù)據(jù)集,包括80 551個(gè)樣本被選中,與正常組織相比,TFF1的mRNA在頭與中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、乳腺癌、食道癌、卵巢癌及胰腺癌中表達(dá)顯著上調(diào),而在結(jié)直腸癌、腎癌及惡性間葉腫瘤中表達(dá)下調(diào)(圖1)。提示TFF1的轉(zhuǎn)錄水平主要取決于腫瘤類型。

    2.2TFF1在ESCA中的表達(dá)情況 從TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中評(píng)估TFF1在多個(gè)ESCA研究中的轉(zhuǎn)錄水平。Oncomine4.5 分析食管癌中 TFF1 mRNA水平顯著高于正常組織(P<0.001,圖2A),差異倍數(shù)均遠(yuǎn)大于2,且TFF1在基于mRNA表達(dá)的前1%的排名中。 其中 Kim 食管癌數(shù)據(jù)集(P<0.001,差異倍數(shù)為173.191)、Kimchi 食管癌數(shù)據(jù)集(P<0.001,差異倍數(shù)為49.848)、食管癌數(shù)據(jù)集(P<0.001,差異倍數(shù)為77.119)。在TCGA中182例ESCA樣本中,在腫瘤及腫瘤等級(jí)的亞群分析中,同樣顯示TFF1為高轉(zhuǎn)錄,且TFF1在Ⅰ期中表達(dá)最高(圖2B)。因此,TFF1表達(dá)可能是ESCA的潛在診斷指標(biāo)。

    左列代表高表達(dá),右側(cè)代表低表達(dá)。 以下參數(shù)用作閾值:P<0.000 1,差異倍數(shù) >2 和基因排名前 10%圖1 TFF1在不同癌癥類型中的mRNA表達(dá)

    2.3ESCA中TFF1的基因組突變情況 使用cBioPortal根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中ESCA患者的測(cè)序數(shù)據(jù),確定ESCA中TFF1改變的類型和頻率。265例ESCA患者中有10例(4%)TFF1發(fā)生改變。這些改變分別為缺失8例(3%)、擴(kuò)增2例(1%),因此,缺失是ESCA中最常見(jiàn)的TFF1突變類型。

    此外,Kaplan-Meier圖顯示,TFF1基因突變與ESCA患者較短的OS有關(guān)(圖3A,P=0.025 8)。這些結(jié)果提示,TFF1基因的突變也可能顯著影響ESCA患者的預(yù)后。接下來(lái)想確定TFF1在ESCA中的生物相互作用網(wǎng)絡(luò)。為此,使用cBioPortal中的基因網(wǎng)絡(luò)(Network),可以進(jìn)一步分析與TFF1相互作用的基因。網(wǎng)絡(luò)包含13個(gè)節(jié)點(diǎn),包括1個(gè)查詢基因TFF1和12個(gè)TFF1鄰近基因。相互作用類型來(lái)源于生物途徑交換(BioPAX):淺色連接表示第一種蛋白控制了改變第二種蛋白狀態(tài)的反應(yīng);深色連接表明這些蛋白質(zhì)是同一復(fù)合體的成員。顏色的深淺代表突變的程度。顏色較深節(jié)點(diǎn)結(jié)包括核受體輔助活化因子1,2,3,雌激素受體1及N-甲基化嘌呤DNA糖基化酶,這些基因在EACA中突變?cè)黾?圖3B)。

    A:TFF1在ESCA組織和正常組織間的表達(dá);B:在ESCA不同分期TFF1 mRNA的表達(dá)圖2 TFF1在ESCA中的表達(dá)情況及ESCA不同分病理分期中的表達(dá)情況(GEPIA)

    A:TFF1在遺傳改變與較短的OS相關(guān);B:TFF在ESCA中的生物相互作用網(wǎng)絡(luò)。TFF1是種子基因(用粗邊框表示)圖3 ESCA中TFF1生物相互作用網(wǎng)絡(luò)及其與ESCA患者的OS關(guān)聯(lián)的分析(cBioPortal)

    2.4ESCA中與TFF1相關(guān)的共表達(dá)基因分析 利用Linked Omics功能模塊分析TCGA中184例ESCA患者的mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)。從火山圖(圖4A)可以看出,5 370個(gè)基因(暗紅點(diǎn))與TFF1呈顯著正相關(guān),896個(gè)基因(暗綠點(diǎn))與TFF1呈顯著負(fù)相關(guān)。圖4B,4C所示為50個(gè)與TFF1呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)的重要基因。TFF1顯示強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)與鈣蛋白酶8(CAPN8,r=0.90,P<0.001),組織蛋白酶E(CTSE,r=0.89,P<0.001),再生基因4(REG4,r=0.88,P<0.001)等具有強(qiáng)相關(guān)性。

    2.5ESCA中與TFF1相關(guān)的共表達(dá)基因GO和KEGG通路分析 基因集富集分析(GSEA)的GO項(xiàng)分析表明,與TFF1相關(guān)的差異表達(dá)基因主要位于微體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體中,主要參與細(xì)胞運(yùn)輸、核苷酸-糖代謝過(guò)程和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等生理過(guò)程。它們的分子功能主要有脂酶活性激活、羧酸酯水解酶活性激活及作用于糖基鍵的水解酶活性激活等(圖5A~5C)。KEGG通路分析顯示,TFF1可能通過(guò)參與NF-κB信號(hào)通路,Hippo信號(hào)通路等在ESCA中發(fā)揮作用(圖5D)。

    A:TFF1與 ESCA中差異表達(dá)基因之間的相關(guān)性;B、C:熱圖顯示在ESCA 中與TFF1 正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因(前 50 名);紅色表示正相關(guān),綠色表示負(fù)相關(guān)圖4 ESCA中與TFF1相關(guān)的差異表達(dá)基因(Linked Omics)

    圖5 ESCA中TFF1的GO功能注釋和KEGG通路富集分析

    3 討 論

    TFF1是三種TFF之一,是一種抗蛋白酶肽,其中包含一個(gè)保守的三環(huán)結(jié)構(gòu)域,稱為TFF結(jié)構(gòu)域〔26~28〕,其主要功能是維持胃腸黏膜的完整性,保護(hù)和修復(fù)受損的上皮細(xì)胞〔11〕。TFF3過(guò)表達(dá)常見(jiàn)于胰腺〔29〕、肝細(xì)胞〔30〕、結(jié)腸〔31〕、胃癌〔32〕,與腫瘤分級(jí)及預(yù)后不良有關(guān)〔33,34〕。胃癌通常表現(xiàn)為TFF1表達(dá)水平降低,TFF1敲除小鼠更容易發(fā)生胃癌〔35〕。TFF1在 結(jié)腸、胰腺和卵巢腫瘤組織中表達(dá)水平較高,與正常腫瘤組織相比,且與刺激細(xì)胞存活、遷移、侵襲性和腫瘤擴(kuò)散相關(guān)。表明TFF1是一種潛在的腫瘤標(biāo)記物〔18~20〕。

    本研究結(jié)果顯示,在ESCA患者中,TFF1過(guò)表達(dá),且其mRNA表達(dá)與患者的個(gè)體癌癥分期顯著相關(guān)。并且發(fā)現(xiàn)ESCA患者TFF1的突變率為4%,且缺失是ESCA中最常見(jiàn)的TFF1突變類型,TFF1基因的突變也可能顯著影響ESCA患者的預(yù)后。功能網(wǎng)絡(luò)分析表明,TFF1可能通過(guò)參與NF-κB信號(hào)通路,Hippo信號(hào)通路等在ESCA中發(fā)揮作用。本研究數(shù)據(jù)表明TFF1的在ESCC的早期診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。TFF1損傷后上調(diào),參與黏膜完整性的維持,參與胃的個(gè)體發(fā)生〔36〕。在胃癌中,TFF1的表達(dá)減少可以有助于促炎和抗凋亡基因的誘導(dǎo)激活NF-κB途徑〔37〕。TFF1在胃中被分為抑癌基因,在其他腫瘤類型中可能也有類似的作用〔38,39〕。例如,在體內(nèi)和體外,TFF1的缺失增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞系MCF7的致瘤能力。同樣,TFF1-KO也通過(guò)7,12-二甲基苯蒽(DMBA)誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生模型〔39〕,增強(qiáng)卵巢和肺的腫瘤形成。之前的研究表明TFF1在Barrett食管中上調(diào),這是一種癌前狀態(tài),會(huì)增加食管腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。我們的結(jié)果證實(shí)了之前的觀察〔40,41〕。這表明TFF1的表達(dá)可能是由酸反流引起的損傷引起的,而酸反流與Barrett食管有關(guān)。

    最近的研究表明,EAC在分子改變方面與胃腺癌相似,而ESCC更接近于頭頸部的鱗癌〔42〕。然而,值得注意的是EAC與染色體不穩(wěn)定性胃癌密切相關(guān),這兩種腫瘤明顯不同于埃巴病毒感染、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和基因組穩(wěn)定性相關(guān)的胃腺癌。由于針對(duì)胃癌中TFF1負(fù)調(diào)控的研究沒(méi)有考慮到這些分子亞群,因此很難確定TFF1缺失是該類型胃癌的共同特征還是亞群特異性的。研究發(fā)現(xiàn)〔43〕,在頭頸部癌癥患者中,上呼吸消化道的鱗狀上皮細(xì)胞發(fā)生改變。在這種情況下,TFF1在早期食管黏膜中作為生物標(biāo)志物的表達(dá)的改變,與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者有最大的相關(guān)性,不僅可以用作早期診斷,也能顯示患者更有可能產(chǎn)生食管第二原發(fā)腫瘤(SPTE)。在唾液腺腫瘤中,相對(duì)于健康組織〔44〕,TFF1、TFF2、TFF3表達(dá)水平較高,而口腔鱗狀細(xì)胞癌中,TFF2、TFF3表達(dá)水平較低,而TFF1表達(dá)水平較高。功能網(wǎng)絡(luò)分析表明,TFF1可能通過(guò)參與NF-κB信號(hào)通路,Hippo信號(hào)通路等在ESCA中發(fā)揮作用。具體通過(guò)哪個(gè)主要途徑發(fā)揮作用,有待進(jìn)一步證實(shí)。

    綜上,ESCA患者TFF1高表達(dá)與臨床癌癥階段等級(jí)有關(guān),在腫瘤Ⅰ期表達(dá)最高。此外,ESCA患者TFF1的突變以缺失為主及TFF1的基因突變與較短的OS有關(guān)。這些結(jié)果表明TFF1可能是一種新的腫瘤標(biāo)志物,為ESCA的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和策略。

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