miR-28-5p和Nrf2與老年腦動(dòng)靜脈畸形出血的關(guān)系

王辰龍 周紅 呼群 張瑞云 張海廷 李志方

(1民航總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(北京大學(xué)民航臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科)，北京 100123；2中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)

腦血管動(dòng)靜脈畸形(AVM)是一種先天性腦血管異常結(jié)構(gòu)疾病，多見于中青年人群，但近年在老年人群中發(fā)病率呈升高趨勢(shì)，臨床表現(xiàn)為動(dòng)靜脈間形成多量短路，形成曲張的血管團(tuán)，且管壁厚薄不一，缺乏內(nèi)彈力纖維層〔1〕。臨床表現(xiàn)為顱內(nèi)出血、癲癇、頭痛，自發(fā)性顱內(nèi)出血是AVM的主要風(fēng)險(xiǎn)，平均出血率為50%～70%，可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙乃至死亡，因此需要積極的治療〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，腦AVM出血與多種因素有關(guān)，有出血傾向的AVM具有一些基本特征，血管病變厚度變薄是主要危險(xiǎn)因素〔3,4〕。血管病變與內(nèi)皮細(xì)胞生長關(guān)系密切，miR-28-5p在細(xì)胞的增生、分化、凋亡、基因表達(dá)等方面起重要作用，可參與細(xì)胞的凋亡和誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上，其高表達(dá)與細(xì)胞因子的產(chǎn)生呈正反饋關(guān)系〔5〕。研究證明miR-28-5p在肺、結(jié)腸癌細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)〔6〕。也有研究表明miR-28-5p在遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(HHT)患者中顯著下調(diào)，而HHT患者可發(fā)展為血管不典型增生，稱為毛細(xì)血管擴(kuò)張和AVM〔7〕。但miR-28-5p在AVM中是否低表達(dá)及與出血是否存在關(guān)系還無相關(guān)研究報(bào)道。核因子無相關(guān)因子(Nrf2)通路是內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的核心調(diào)控樞紐,通過一系列抗氧化劑保護(hù)蛋白編碼，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境的條件調(diào)節(jié)〔8〕。血管通透性增加可導(dǎo)致許多疾病相關(guān)的血管并發(fā)癥發(fā)生，活性氧(ROS)的過度生成或抗氧化能力的降低可導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，作為過量ROS的平衡物，Nrf2作為一種氧化還原敏感的細(xì)胞保護(hù)性轉(zhuǎn)錄因子，將成為抗氧化防御的潛在治療靶點(diǎn)〔9〕。本文探究miR-28-5p 與Nrf2在老年AVM中的表達(dá)并分析其與出血的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年2月至2018年2月民航總醫(yī)院就診的腦血管AVM未出血患者32例為血管畸形組，年齡60～79歲。Spetzler&Martin分級(jí)Ⅰ級(jí)7例，Ⅱ級(jí)11例，Ⅲ級(jí)10例，Ⅳ級(jí)4例。收集AVM出血患者25例為出血組，年齡60～80歲。Ⅰ級(jí)6例，Ⅱ級(jí)6例，Ⅲ級(jí)9例，Ⅳ級(jí)4例。另選取健康體檢者30例為健康組，年齡59～78歲。癲癇患者27例為癲癇組。收集AVM出血組織3例，AVM患者的畸形血管團(tuán)6例，癲癇患者的顳淺靜脈2例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)CT、DSA、MRI檢查確診為腦血管AVM，(2)無高血壓及其他心腦血管疾病或重大疾病；(3)出血患者經(jīng)治療后病情穩(wěn)定。排除臨床資料不全，患有其他嚴(yán)重疾病患者。參與研究者均簽署知情同意書，研究通過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，4組性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、病情分級(jí)方面無明顯差異。見表1。

1.2儀器與試劑 熒光檢測(cè)試劑實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR，Promega公司，美國)，miR-28-5p NRf2、內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增引物(Biosail公司、加拿大)、9700RT-PCR儀(ABI公司，美國)。

1.3研究方法 (1)每3個(gè)月測(cè)定一次各組外周血miR-28-5p 與Nrf2的mRNA含量，研究期間新出現(xiàn)出血情況患者待治療穩(wěn)定后重新檢測(cè)，計(jì)算中間值，高于等于中間值為強(qiáng)表達(dá)，低于中間值為弱表達(dá)。(2)隨訪2年，經(jīng)CT、數(shù)字減影血管造影(DSA)、磁共振成像(MRI)復(fù)查，統(tǒng)計(jì)AVM患者出血情況并進(jìn)行檢測(cè)，術(shù)后檢測(cè)在1 w內(nèi)完成。

1.4腦AVM內(nèi)皮細(xì)胞分離和鑒定 將手術(shù)切除的腦 AVM 血管浸入含慶大霉素、兩性霉素 B 及鏈霉素青霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。在超凈臺(tái)仔細(xì)清除多余血管組織，顯微鏡下用眼科剪剪除血管外膜，PBS反復(fù)沖洗血管腔，至沖洗液中無肉眼可見的紅細(xì)胞及血管腔內(nèi)壁發(fā)白。用1 ml 注射器抽取 0.2%膠原酶Ⅰ200 μl，向血管內(nèi)注入，使血管腔內(nèi)充滿膠原酶，37℃孵育10 min。含 20%血清的 MCDB131 培養(yǎng)液沖洗管腔2次并收集灌洗液，保證灌洗液完全排出。1 500 r/min離心5 min，倒掉上清液加入 EGMTM-2 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。接種于 24 孔培養(yǎng)板，將培養(yǎng)板置于5% CO237℃培養(yǎng)箱孵育 24 h內(nèi)勿動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞靜止生長。將剩余血管用眼科剪剪碎，0.2%膠原酶Ⅰ500 μl，37℃ 孵育10 min。用含20% 血清的 MCDB131 培養(yǎng)液終止膠原酶消化。用 45 μm 細(xì)胞篩過濾，收集濾液。1 500 r/min離心5 min，倒掉上清液加入 EGMTM-2 培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于 24 孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置于5% CO237℃培養(yǎng)箱孵育 24 h后換液,以后每隔 2 天換液 1 次。出血、癲癇患者顳淺靜脈原代培養(yǎng)方法同腦AVM。將分離出來的各組細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選后得到所需內(nèi)皮細(xì)胞。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)與處理 將各組細(xì)胞復(fù)蘇后，在EGMTM-2 培養(yǎng)在37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h，分別將細(xì)胞分為：健康組、癲癇組、血管畸形組、出血組、癲癇+Brustaol(Nrf2抑制劑)組、血管畸形+Brustaol組、出血+Brustaol組。按比例加入相應(yīng)體積的藥物進(jìn)行處理，混勻后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.6采用RT-PCR法測(cè)定患者外周血及各組細(xì)胞中miR-28-5p的表達(dá) 分別采集血管畸形組、出血組治療后1 d、健康組空腹時(shí)靜脈血3～5 ml，抗凝處理，放入7 000 r/min離心機(jī)，離心1 min，沉淀分離細(xì)胞核；分別將分組細(xì)胞7 000 r/min離心1 min，分離細(xì)胞核。常規(guī)用Trizol提取單個(gè)細(xì)胞核總RNA，按說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行熒光檢測(cè)。PCR體系為2倍的GoTaq qPCR、樣本cDNA 0.2 μg、蒸餾水，建立40 μl的反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為96℃ 2 min，96℃ 20 s，55℃ 15 s，72℃ 40 s 連續(xù)40個(gè)循環(huán)?！癈t值倒數(shù)”法計(jì)算樣本cDNA相對(duì)含量，即目的基因 cDNA相對(duì)含量=目的基因 Ct值倒數(shù)/GAPDH Ct值倒數(shù)。

1.7采用Western印跡檢測(cè)外周血及各組細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)水平 采用放射免疫沉淀(RIPA)裂解緩沖液(Beyotime)加上蛋白酶抑制劑(PMSF)(Yeason，中國上海)提取總蛋白。用二喹啉甲酸(BCA)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%牛血清白蛋白封閉60 min后，用小鼠抗人單克隆Nrf2和GAPDH(1∶10 000，ab8245，Abcam)在4℃下過夜。然后將膜暴露在二抗體中60 min。用電化學(xué)發(fā)光(ECL)-Plus印跡試劑盒孵育條帶，并用成像系統(tǒng)(中國上海塔農(nóng))進(jìn)行分析。

1.8評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) Spetzler-Martin分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：病灶體積:0.0～3.0 cm為1分，3.1～6.0 cm為2分，>6.0 cm為3分;位置:位于語言區(qū)為1分，非語言取0分;深靜脈引流:有1分，無0分。以上3項(xiàng)之和為總分1～5分，分級(jí)Ⅰ～Ⅴ級(jí)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.14組miR-28-5p、Mrf2表達(dá)差異 健康組、癲癇組、血管畸形組、出血組外周血中miR-28-5p依次呈顯著低表達(dá)(P<0.05)；Nrf2蛋白依次呈高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

2.2AVM不同病情分級(jí)miR-28-5p 與Nrf2蛋白表達(dá) 57例AVM患者中，不同病情分級(jí)對(duì)應(yīng)的miR-28-5p 表達(dá)均隨著病情分級(jí)增加表達(dá)減弱，Nrf2蛋白表達(dá)隨著病情分級(jí)增加表達(dá)增強(qiáng)，不同分級(jí)之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖2。

表1 4組一般資料及外周血miR-28-5p 、Nrf2表達(dá)比較

圖1 各組外周血Nrf2 蛋白表達(dá)

表2 AVM不同病情分級(jí)miR-28-5p與Nrf2表達(dá)

圖2 不同病情分級(jí)Nrf2 蛋白表達(dá)

2.3相關(guān)性 病情分級(jí)(r=-0.435，P=0.002)、出血(r=-0.651,P=0.000)與miR-28-5p呈負(fù)相關(guān)，與Nrf2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.806、0.752，均P=0.000)。

2.4出血風(fēng)險(xiǎn)與miR-28-5p與Nrf2表達(dá)的危險(xiǎn)因素cox回歸分析 血管畸形組隨訪期14例出現(xiàn)出血癥狀，單因素回歸分析顯示出血危險(xiǎn)與miR-28-5p 弱表達(dá)相關(guān)(P<0.05)，與Nrf2強(qiáng)表達(dá)相關(guān)(P<0.05)，見表3。

2.5miR-28-5p與Nrf2 相關(guān)性及診斷AVM敏感性 腦AVM患者miR-28-5p與Nrf2呈負(fù)相關(guān)(r=-0.518，P=0.035 7),受試者工作特征(ROC)曲線表明,miR-28-5p水平可用于篩查腦AVM,曲線下面積為0.916 3(圖3)。

2.6使用Nrf2抑制劑后各組miR-28-5p的表達(dá)水平 健康組miR-28-5p表達(dá)水平為0.23±0.08。血管畸形+Brustaol組、出血+Brustaol組、癲癇+Brustao組miR-28-5p表達(dá)水平(0.75±0.13、1.36±0.15、0.62±0.10)較血管畸形組、出血組、癲癇組(0.31±0.09、0.64±0.13、0.29±0.06)顯著提高(均P<0.05)。

表3 血管畸形組腦出血危險(xiǎn)單因素cox回歸分析

3 討 論

出血是AVM最嚴(yán)重的并發(fā)癥，多發(fā)生在腦內(nèi)，而老年人因身體功能和耐受力下降，動(dòng)脈畸形出血率較高，危害性大〔10～12〕。出血型AVM的病理研究顯示電鏡下可見血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死脫落，內(nèi)膜和中膜變性，平滑肌細(xì)胞壞死崩解，內(nèi)彈力層破壞厚薄不均，存在斷裂的情況。對(duì)AVM的超微病理進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，AVM血管壁的病理改變主要為血管內(nèi)膜的變化，強(qiáng)調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)內(nèi)彈力層具有營養(yǎng)和保護(hù)作用〔13〕。miR-28-5p 和Nrf2是可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的相關(guān)因子，且與心血管疾病關(guān)系密切〔14,15〕。

miRNA 表達(dá)具有高度的組織特異性、保守性及發(fā)育階段特異性，miRNA在血液中檢測(cè)與機(jī)體疾病具有一定相關(guān)性，可作為一些疾病的標(biāo)志物〔16〕。特別是miR-28-5p 的表達(dá)和炎癥因子的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其表達(dá)的下調(diào)能夠激活核因子(NF)-κB信號(hào)通路，可促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)〔17〕。研究通過對(duì)高血壓腦出血患者外周血單個(gè)細(xì)胞核檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-28-5p mRNA 呈現(xiàn)低表達(dá)，表達(dá)程度與出血正相關(guān)；大鼠局灶性腦缺血再灌注后miR-28-5p 表達(dá)降低，在出血周圍組織中呈陽性表達(dá)〔18〕。本研究提示miR-28-5p 在AVM病情中發(fā)揮重要作用，在出血組低表達(dá)可能是由于出血后形成的血腫周圍存在一個(gè)組織損傷刺激產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，miR-28-5p 在細(xì)胞炎癥反應(yīng)中同樣發(fā)揮重要作用，AVM的病情是一個(gè)持續(xù)發(fā)展的過程，推測(cè)AVM患者血管內(nèi)皮細(xì)胞的病理損傷是導(dǎo)致了miR-28-5p 的表達(dá)升高的原因。

Nrf2是調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，可介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激，抗炎癥，抗凋亡是細(xì)胞抵抗外界不良環(huán)境〔19〕。ROS在血管穩(wěn)態(tài)調(diào)控中有重要性，過量的ROS可導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞死亡。正常情況下細(xì)胞質(zhì)中Nrf2濃度低，氧化應(yīng)激時(shí)Nrf2轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，引發(fā)抗氧化酶，抗炎癥基因等內(nèi)源性保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄，抵抗氧化作用保護(hù)組織免受傷害〔20,21〕。針對(duì)兔的蛛網(wǎng)膜出血的Nrf2研究顯示，出血組織中Nrf2表達(dá)增加，且陽性表達(dá)集中在血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞〔22〕。本研究提示Nrf2在AVM出血中發(fā)揮一定作用，推測(cè)腦出血導(dǎo)致大量ROS釋放，Nrf2通路被激活，表達(dá)增強(qiáng)，激活下游抗氧化酶，能有效減輕繼發(fā)性腦損傷，且出血部位的炎癥反應(yīng)同時(shí)激活了Nrf2誘導(dǎo)抗炎反應(yīng)的功能。AVM患者由于先天發(fā)育不良、血管生長畸形，研究顯示AVM基因型最顯著的特點(diǎn)就是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的mRNA及蛋白水平均較正常呈高表達(dá)狀態(tài)〔23〕，促進(jìn)AVM的生長過程中新生血管的增長，也導(dǎo)致了AVM生長階段miR-28-5p和Nrf2的表達(dá)增強(qiáng)〔24,25〕。AVM臨床分級(jí)復(fù)雜，存在多種標(biāo)準(zhǔn)，Spetzler&Martin分級(jí)是應(yīng)用廣泛的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)之一，臨床上可根據(jù)AVM分級(jí)判斷病情制定相應(yīng)的治療方案預(yù)測(cè)手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，級(jí)別越高，手術(shù)并發(fā)癥越高〔26〕。本研究中，不同病情分級(jí)、出血與miR-28-5p呈負(fù)相關(guān)，與Nrf2呈正相關(guān)。分析原因可能是由于AVM分級(jí)越高AVM病灶越大，新生血管生長活動(dòng)越發(fā)活躍，導(dǎo)致了Nrf2的表達(dá)增強(qiáng)和miR-28-5p 減弱。體外研究提示miR-28-5p與Nrf2呈負(fù)相關(guān)。AVM的治療采用顯微手術(shù)為主，也存在藥物血管內(nèi)治療，放射療法等以實(shí)現(xiàn)阻塞血管為目的的治療手段，但由于治療效果可控性差，并發(fā)癥難以控制，應(yīng)用較少〔27,28〕。根據(jù)miR-28-5p 和Nrf2在AVM中的表達(dá)可設(shè)想通過抑制miR-28-5p 和Nrf2表達(dá)實(shí)現(xiàn)抑制AVM生長的目的，尤其對(duì)老年患者保守治療具有很高價(jià)值。

綜上，miR-28-5p 和Nrf2在老年腦AVM患者中呈現(xiàn)高表達(dá)，與臨床分級(jí)正相關(guān)，是臨床出血并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素，本研究由于樣本量較少，可能存在一定的偏倚，可通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論，為老年AVM患者治療提供指導(dǎo)。