傣藥紅花臭牡丹根飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陸應(yīng)彩 彭 霞 李 清 卯明霞 仁紹坤

西雙版納州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 景洪 666100

紅花臭牡丹根飲片為馬鞭草科植物赪桐Clerodendrumjaponicum(Thunb.)Sweet的干燥根的加工炮制品。紅花臭牡丹根的藥材標(biāo)準(zhǔn)收載于《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2005年版第三冊[1]，西雙版納地區(qū)傣醫(yī)將紅花臭牡丹根稱為“哈賓亮”，意譯為“療效顯著，名貴價(jià)高”[2-5]，傣醫(yī)是四大民族醫(yī)藥之一，紅花臭牡丹根、葉均作藥用，為傣醫(yī)常用藥，具有清火解毒、活血止血、調(diào)經(jīng)通乳、除風(fēng)止痛、補(bǔ)土健胃的功效，用于治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、赤白帶下、產(chǎn)后缺乳；六淋證出現(xiàn)的小便熱澀疼痛、尿黃、尿血；睪丸腫痛；脘腹脹痛，不思飲食，四肢乏力；風(fēng)濕病關(guān)節(jié)肌肉腫痛[2-5]。預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]表明，紅花臭牡丹根主要含有鞣質(zhì)、酚酸類、黃酮類及揮發(fā)油等成分。近代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有神經(jīng)保護(hù)、抗心肌缺血、抗胃潰瘍、抗炎、抗腫瘤以及降糖等藥理作用[8-11]。而目前尚無紅花臭牡丹根飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[1-2]。故本文建立紅花臭牡丹根飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[12]，且參照《赪桐根中總黃酮的提取工藝》[7]及《腎茶總黃酮的含量測定》[13]采用蘆丁為對照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色后，用紫外分光光度法對紅花臭牡丹根飲片中總黃酮的含量進(jìn)行研究以有效控制其質(zhì)量并為其應(yīng)用提供保障。紅花臭牡丹植物圖如圖1。

(a)生境圖

(b)生境圖

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2600紫外分光光度計(jì)(島津)；BGZ-76電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；SX2-4-10箱式電阻爐；TLCVisualizer2薄層色譜成像儀(瑞士卡瑪)；OLYMPUS BX41生物顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司)；BL310天平(德國賽多利斯集團(tuán))；AE200電子天平[梅特勒-托里多儀器(上海)有限公司,型號：MS205DU]；LC-300B數(shù)控超聲波清洗器(濟(jì)南市中區(qū)魯超儀器廠)；UPH-IV-20T超出水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；DFT-100A高速萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；CAMAG Linomat 5半自動薄層點(diǎn)樣儀(瑞士卡瑪)；TLC Visualizer 2薄層色譜成像儀(瑞士卡瑪)；RE-20000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SPS-04L氣相色譜儀(安捷倫科技)。

1.2 試藥 不同產(chǎn)地的10批藥材分別采自云南景洪市、云南勐?？h、云南勐臘縣。由西雙版納州食品藥品檢驗(yàn)所彭霞主任藥師鑒定為馬鞭草科植物臭茉莉ClerodendrumphilippinumSchau. var. simplex C. Y. Wu et R. C. Fang。蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201610，含量UV法測定，以92.6%計(jì))。無水乙醇(分析純)、氫氧化鈉(優(yōu)級純)、亞硝酸鈉(分析純)、硝酸鋁(分析純)、石油醚(分析純)、丙酮(分析純)、鹽酸(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)、硫酸(分析純)、二氯化鉀、水合氯醛等均為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 本品為大小不一的類圓形及不規(guī)則塊片，厚0.2～1.0 cm。外表面灰棕色至黃棕色，具不規(guī)則細(xì)皺紋，有少數(shù)凸起的支根痕。質(zhì)硬，切面皮部較薄，木部寬廣，黃白色，有橫向裂紋，有的莖木髓部中空。氣微，味淡。如圖2所示。

圖2 紅花臭牡丹根飲片圖

2.2 顯微特征 粉末淡黃色。木栓細(xì)胞黃棕色，類長方形或類多角形，壁不甚厚；韌皮纖維多單個(gè)散在，長梭形，壁厚，孔溝明顯，直徑約為17～19 μm；木纖維成束，孔溝不明顯，直徑約為16～17 μm。導(dǎo)管為具緣紋孔，紋孔排列緊密，直徑約為43～59 μm；石細(xì)胞眾多，呈類方形、類長方形或類三角形，單個(gè)散在或集聚成群，壁厚，孔溝明顯，胞腔內(nèi)大多含草酸鈣方晶，直徑25～50 μm。淀粉粒眾多，大小不一，多單粒，呈類圓形或類橢圓形，臍點(diǎn)十字形、裂縫狀、點(diǎn)狀，直徑4～12 μm；復(fù)粒多由2～4分粒組成。草酸鈣方晶直徑11～22 μm?！对颇鲜≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]收載“紅花臭牡丹根”項(xiàng)下，未入標(biāo)準(zhǔn)。如圖3所示。

2.3 薄層色譜鑒別 取本品粉末 1 g，加乙醇 15 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取紅花臭牡丹根對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》四部通則0502)[14]試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各 10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)- 丙酮(8∶2)為展開劑，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]收載“紅花臭牡丹根”項(xiàng)下有薄層色譜鑒別一項(xiàng)。已納入標(biāo)準(zhǔn)。按照藥材薄層色譜條件，檢測三個(gè)不同產(chǎn)地10批紅花臭牡丹根飲片，薄層色譜圖均一致，重現(xiàn)性好，符合規(guī)定，納入標(biāo)準(zhǔn)。如圖4所示。

2.4 檢查項(xiàng)與浸出物 參照《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]收載“紅花臭牡丹根藥材”項(xiàng)下的規(guī)定及《中國藥典》(2015版四部通則)[14]測定三個(gè)不同產(chǎn)地10批紅花臭牡丹根飲片樣品的水分(通則0832第二法)、總灰分(通則2302)、酸不溶性灰分(通則2302)、砷鹽(通則0822第一法)，重金屬(通則0821第二法)、有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量(通則2341，測定9種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量)總六六六(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC之和)、總滴滴涕(p,p＇-DDE、p,p＇-DDD、o,p＇-DDT、p,p＇-DDT之和)、五氯硝基苯；浸出物(通則2201用水作溶劑照水溶性浸出物測定法項(xiàng)下的熱浸法)。各項(xiàng)測定結(jié)果均符合規(guī)定，結(jié)果均見表1。

表1 各項(xiàng)測定結(jié)果及限度 (n=2)

2.5 總黃酮的的含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品適量，置 100 mL 量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取 20 mL，置 50 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得(每 1 mL 中含蘆丁 0.3 mg)。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品溶液0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、5、6 mL，分別置于 25 mL 量瓶中，各加水至 6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液 1 mL，搖勻，放置 6 min，加10%硝酸鋁溶液 1 mL，搖勻，放置 6 min，加氫氧化鈉試液 10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置 15 min，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法(通則0401)[14]，在 357 nm 波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5.3 測定法 取本品粉末約 0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入80%乙醇溶液 100 mL，稱定重量，置 85 ℃ 水浴上回流 1 h，放至室溫，稱定重量，用80%乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液 10 mL，置 25 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取 5 mL，置 25 mL 量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加水至 6 mL”起依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量。按干燥品計(jì)算，含總黃酮以蘆丁(C27H30O16)計(jì)算。

2.5.4 吸收光譜的測定、光譜一致性檢測 精密吸取蘆丁對照品溶液、供試品溶液各 5 mL，分別置于 25 mL 量瓶中，照分光光度法，在200～800 nm 波長范圍內(nèi)測定吸收光譜，結(jié)果蘆丁對照品與供試品光譜吸收圖譜基本一致，在 357 nm 處有最大吸收。參照赪桐根中總黃酮的提取工藝優(yōu)選[7]及腎茶中總黃酮的含量測定方法[2]，選取 357 nm 為檢測波長。

2.5.5 線性關(guān)系考察 精密量取蘆丁對照品溶液0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、5、6 mL(相當(dāng)于蘆丁2.86282、5.72567、8.58846、11.45129、22.90257、34.35386、45.80515、57.25643、68.70772 μg/mL)，按上述測定法測定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程：Y=0.0287528X+0.00831103，r2=0.99985，結(jié)果表明蘆丁在2～68 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.6 精密度試驗(yàn) 取同一批樣品6份(產(chǎn)地：西雙版納景洪市曼蚌湯，批號：20190702)，按供試品測定方法測定，總黃酮的平均含量為5.32%，RSD為1.5%。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取2.5.1對照品溶液(22.90257 μg/mL)，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，依次測定7次，以吸收度值計(jì)算RSD為0.16%，結(jié)果符合要求。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 根據(jù)《中國藥典》2015版四部(通則9101)[14]，藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中準(zhǔn)確度相關(guān)規(guī)定，設(shè)計(jì)同一濃度，9份供試品溶液按2.5.3方法進(jìn)行測定。該分析方法的回收率為101.17%～107.89.20%，且RSD為2.4%，結(jié)果符合要求。

2.5.9 樣品測定 取不同產(chǎn)地的10批紅花臭牡丹根飲片，按照上述方法制備供試品溶液，按2.5.2確定工作曲線，以干燥品計(jì)算總黃酮含量。測定結(jié)果均符合規(guī)定，結(jié)果見表1。

3 討論

3.1 試驗(yàn)條件的考察

3.1.1 含量測定試驗(yàn) 以蘆丁為對照品采用分光光度法，以相應(yīng)的試劑為空白，分別考察溶劑: 50% 乙醇、60%乙醇、70% 乙醇、80%乙醇；提取方式: 回流提取時(shí)間分別為60 min、90 min、120 min; 回流溫度分別為75 ℃、85 ℃、95 ℃ ； 超聲處理分別為30 min、45 min、60 min；溶劑量分別為25 mL、50 mL、100 mL；取樣量分別為0.25 g、0.5 g、1.0 g、1.5 g制備的供試品溶液，在357 nm 波長處測定吸光度，計(jì)算總黃酮的含量。結(jié)果表明，取樣量為0.25 g，100 mL 80%乙醇為溶劑85 ℃回流提取，紅花臭牡丹根中總黃酮的溶出量最大，因此選取此方法制備供試品溶液。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明供試品溶液在30分鐘內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.2 薄層色譜鑒別 本次飲片研究考察了薄層色譜的耐用性。不同廠牌的薄層板，硅膠G薄層板(青島海洋化工廠、青島譜科分離材料有限公司、青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司)；其它的方法驗(yàn)證《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]已收載。

3.2 限度擬定 各項(xiàng)限度是根據(jù)各測定結(jié)果照《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]收載“紅花臭牡丹根藥材”項(xiàng)下的限度擬定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行擬定，具體見表1。鑒于砷鹽均符合規(guī)定暫不納入標(biāo)準(zhǔn)，重金屬均小于百萬分之十暫不納入標(biāo)準(zhǔn)，有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量中總六六六(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC之和)、總滴滴涕(p,p＇-DDE、p,p＇-DDD、o,p＇-DDT、p,p＇-DDT之和)、五氯硝基苯均未檢出故不納入標(biāo)準(zhǔn)。