維吾爾藥材睡蓮花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

趙榮梅 艾買提江·阿衣甫別克 徐 鴻 于新蘭 馬國明

新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗研究院 中藥(維藥)質(zhì)量控制重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054

睡蓮花是睡蓮科睡蓮屬植物雪白睡蓮(Nymphaeacandida)的干燥花蕾，該植物生在池沼中，分布廣泛，主產(chǎn)于新疆伊犁、阿勒泰和博湖地區(qū)，西伯利亞、中亞、歐洲也有分布[1]。維吾爾醫(yī)認(rèn)為睡蓮花性質(zhì)二級濕寒，具有降熱止渴、益心護(hù)腦、祛乃孜來等功效，用于感冒發(fā)熱、頭痛咳嗽、心悸不安、咽痛解毒等[2-3]。文獻(xiàn)[4-10]報道,睡蓮花含有黃芪苷、煙花苷、紫云英苷、槲皮素3-O-木糖苷、槲皮素、槲皮素3′-O-β-D-吡喃木糖苷、異槲皮苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、蘆丁等化學(xué)成分。

睡蓮花作為維吾爾醫(yī)的常用藥材，在祖卡木顆粒、炎消迪娜兒糖漿、降熱比那甫西糖漿等成藥的處方中均有使用?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》維吾爾藥分冊中[3]，內(nèi)容只有性狀、粉末顯微鑒別等項目。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善導(dǎo)致企業(yè)無法全面控制藥材質(zhì)量。本研究的目的在于對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)研究，保證用藥安全。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BX-51型生物顯微照相系統(tǒng)(OLYMPUS)；CAMAG TLC Visualizer型薄層色譜成像系統(tǒng)(瑞士卡瑪)；KUDOS SK7210LHC型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；CAMAG AUTOMATIC TLC SAMPLER 4全自動點樣儀；高效液相色譜儀(Agilent 1260型，DAD檢測器；島津LC-2010型，VWD檢測器；Thermo Ulltimate 3000型；紫外檢測器)；MS 204S型電子天平(Mettler toledo)；XT-1000A 型高速多功能粉碎機(jī)(浙江永康市紅太陽機(jī)電有限公司)。

1.2 材料 山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品(批號：112007-201602，含量：90.8%，中國食品藥品檢定研究院)，硅膠G薄層預(yù)制板(批號：20200430，煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所)；甲醇、乙腈為色譜級(Thermo Fisher)，其他試劑均為分析純。

睡蓮花藥材購自于新疆不同地區(qū)民族藥材市場和民族醫(yī)院，共19批次(產(chǎn)地為新疆的樣品批號為：yfb1712004、yfb1712005、yfb1712006、Y1711021、H30134102、SLH-YP-170830、20170903；產(chǎn)地為巴基斯坦的樣品批號為：20170905、1706018、170422；產(chǎn)地為河北白洋淀的樣品批號為：yfb1712001、yfb1712002、yfb1712003、yfb1712007、yfb1712008、yfb1712009、Y1709009；產(chǎn)地為云南的樣品批號為:201608；產(chǎn)地為成都的樣品批號為：20170904)。由新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗研究院蘇來曼·哈力克教授鑒定為睡蓮科睡蓮屬雪白睡蓮Nymphaeacandida。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 本品呈圓錐形或長圓形，多皺縮破碎?；ɡ匍L2.5～4.5 cm，直徑約2 cm，花托略呈方形。殘留花梗，有縱棱，表面被短絨毛。花萼4，革質(zhì)，近離生，長卵狀披針形，無毛，表面綠色或黃棕色。剝?nèi)セㄝ嗫梢姲咨螯S白色花瓣。雄蕊多數(shù)，花藥線形，花絲扁平，幾與花藥等長。子房球形或橢圓形，無花柱或極短，柱頭密排成輪狀，中部有凹陷。氣微，味淡。如圖1所示。

圖1 生態(tài)和性狀特征圖

2.2 顯微鑒別 分別取藥材細(xì)粉適量，置載玻片上，加水合氯醛溶液透化后，置顯微鏡下觀察，拍照記錄。如圖2所示。結(jié)果可見：腺毛頭部類圓形，由1～3細(xì)胞組成。非腺毛海星狀，或碎斷，基部細(xì)胞類方形，表面附有大量草酸鈣方晶。花粉粒類圓形，直徑30～60 μm。薄壁細(xì)胞中可見大量草酸鈣結(jié)晶(砂晶、方晶或簇晶)。

草酸鈣方晶;海星狀非腺毛;花粉粒類圓形;腺毛圖2 顯微特征圖

2.3 TLC鑒別 取本品粉末1 g，加甲醇10 mL，超聲處理20 min，濾過，作為供試品溶液。另取山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品適量，加甲醇制成1 mL含0.2 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2020年版四部通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點。如圖3所示。

2.4 水分測定 按照《中國藥典》2020年版四部通則“0832第二法”測定水分。見表1。

2.5 總灰分和酸不溶性灰分測定 按照《中國藥典》2020年版四部通則“2302灰分測定法”測定。見表1。

2.6 浸出物測定 按照《中國藥典》2020年版四部通則“2201浸出物測定法”測定，以水和不同濃度的乙醇為溶劑，采用熱浸法和冷浸法分別測定浸出物含量，確定提取方式為以70%乙醇溶液為溶劑，采用熱浸法測定醇溶性浸出物含量。見表1。

2.7 含量測定方法的建立

2.7.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，按表2中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為350 nm，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL。理論板數(shù)按山柰酚-3-O-蕓香糖苷峰計算應(yīng)不低于 4000。

表2 色譜條件

2.7.2 對照品溶液的制備 取山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇分別制成每1 mL含24 μg的溶液，即可。

2.7.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末(過三號篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.7.4 系統(tǒng)適用性試驗

2.7.4.1 線性關(guān)系的考察 精密量取山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品溶液(51.07 μg/mL)1、2、3、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.7.1”色譜條件測定，以對照品溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=16.936×C+1.7465(r=0.9999)。結(jié)果表明，山柰酚-3-O-蕓香糖苷濃度在5.11～51.07 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.7.4.2 重復(fù)性試驗 取同一批號供試品(批號：SLH-YP-170830)，按照“2.7.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.7.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，測定山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量。以6次測定結(jié)果計算RSD值，結(jié)果山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量的RSD值為1.76%(n=6)，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.7.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批號供試品溶液(批號：SLH-YP-170830)，分別于0、2、4、6、8、12、14、18、24和32 h進(jìn)樣分析，測定山柰酚-3-O-蕓香糖苷的峰面積。以10次測定的峰面積值計算RSD值，結(jié)果山柰酚-3-O-蕓香糖苷峰面積的RSD值為0.32%。表明供試品溶液在室溫放置32 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.4.4 精密度試驗 取同一批號供試品溶液(批號：SLH-YP-170830)，按照“2.7.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以6次峰面積值計算RSD值。結(jié)果山柰酚-3-O-蕓香糖苷峰面積的RSD值為0.28%，表明本方法精密度良好。

2.7.4.5 回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品(批號：SLH-YP-170830)0.1 g，9份，分別置于置具塞錐形瓶中，精密加入對照品溶液適量，按照“2.7.3”項下方法制備得到高、中、低濃度的加標(biāo)溶液。按照“2.7.1”色譜條件進(jìn)樣分析，計算山柰酚-3-O-蕓香糖苷回收率。結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗數(shù)據(jù) (n=9)

2.7.4.6 靈敏度 當(dāng)S/N為3時，溶液濃度為檢出限，即為0.145 μg/mL，RSD為1.9%；當(dāng)S/N為10時，溶液濃度為定量限，即為1.146 μg/mL，RSD為 1.8%。

2.7.5 供試品的測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按照“2.7.1”色譜條件測定，即得，按干燥品以外標(biāo)法計算含量。如圖4所示及表4。

A.對照品溶液色譜圖 B.供試品溶液色譜圖圖4 HPLC色譜圖

表4 樣品含量測定數(shù)據(jù)

3 討論

3.1 含量測定方法的考察 在考察樣品前處理方法時，采用50%、70%、100%的甲醇和乙醇溶液作為提取溶劑，以1∶100、1∶125、1∶250、1∶500 作為料理比，超聲時間分別為15、20、25和30 min提取，對同一批次睡蓮花樣品中的山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量進(jìn)行測定，選擇含量最高的提取方式為70%乙醇溶液為溶劑，超聲功率為250 W，超聲時間為30 min。在考察方法耐用性時，分別考察了不同品牌高效液相色譜儀、不同品牌及批號的同類型色譜柱、儀器流速、儀器柱溫對含量測定結(jié)果的影響。實驗結(jié)果表明，這些影響因素均未對測定結(jié)果有明顯的影響。

3.2 檢驗項目限度的初步探索 本研究收集的樣品具有代表性，水分含量為8.12%～10.39%，平均值為9.35%；總灰分含量為8.22%～11.76%，平均值為9.83%；酸不溶性灰分為0.11%～2.30%，平均值為1.18%；浸出物含量為31.47%～40.79%，平均含量為35.63%。與藥材生長環(huán)境、產(chǎn)地的大陸性氣候、炮制等相結(jié)合，擬定藥材水分限度為不得過 12.0%；總灰分限度為不得過12.0%；酸不溶性灰分限度為不得過2.0%；浸出物含量限度為不得低于30.0%。山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量(%)為0.22% ± 0.035%(n=19)，按照國家藥典委員會中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求，按其平均值的±20%作為限度的制定幅度，以干燥品來計算含量，擬定含量限度為不得少于0.17%，并列入該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案正文內(nèi)容。

《中國植物志》中記載標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的雪白睡蓮在國內(nèi)產(chǎn)于新疆，本課題組在收集樣品時發(fā)現(xiàn)我國云南、成都、河北等地也生長雪白睡蓮。因此，本課題組將這些產(chǎn)地的雪白睡蓮也納入研究范圍，通過數(shù)據(jù)分析得知，河北白洋淀產(chǎn)的水分、總灰分和酸不溶性灰分含量最高，新疆和巴基斯坦進(jìn)口的次之，成都和云南產(chǎn)的最低；但成都和云南產(chǎn)的浸出物和煙花苷含量最高，新疆和巴基斯坦進(jìn)口的次之，河北白洋淀產(chǎn)的最低。此次對睡蓮花藥材進(jìn)行了系統(tǒng)研究，修訂了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)較全面反應(yīng)睡蓮花藥材的質(zhì)量。通過此次對雪白睡蓮花的初步探索，對藥材流通和質(zhì)量監(jiān)管方面具有一定的意義。