民族藥黑鎖梅根的生藥學(xué)研究

段烘葉 張 潔 楊竹雅 楊劍啟 余遠(yuǎn)盼 楊明瑞 龔大偉 李學(xué)芳*

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500； 2.楚雄彝族自治州食品藥品檢驗所，云南 楚雄 67500

黑鎖梅根為薔薇科懸鉤子屬植物紅泡刺藤RubusniveusThunberg.的根[1]。別名鉤絲刺、栽秧苗、鉆地風(fēng)、黑黃泡、冒毒紹勞聶(彝族名)、安何肋輕肯(納西族名)。具有祛風(fēng)除濕、解毒止痢等功效[2-3]。納西族將根用于痢疾、胃痛、急慢性腎炎、附件炎、疝氣、遺精、盜汗。藏族將去皮枝干用于流感、感冒、惡寒發(fā)熱、肺結(jié)核、頭痛、身痛[4]。研究[5-6]表明，紅泡刺藤含有酚酸類、萜類、黃酮類和維生素等活性成分。黃酮具有抗炎癥、抗過敏、抑制細(xì)菌、防治心腦血管疾病和抗腫瘤等作用[7]。黑鎖梅根是我省少數(shù)民族常用藥，在云南全省都有分布[8]，資源豐富，開發(fā)前景可觀。目前，我國對黑鎖梅根的研究主要集中在種質(zhì)資源的評價和利用[9]；果實的研究主要有品質(zhì)評價、生物活性成分的提取和抗氧化性等方面[10-12]。在性狀鑒別、顯微鑒別及理化鑒別方面尚屬空白，為了確保臨床用藥的準(zhǔn)確性、有效性和安全性，本實驗對該藥材進(jìn)行了系統(tǒng)的生學(xué)藥研究，為進(jìn)一步的深入研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Nikon E100型生物顯微鏡、生物數(shù)碼攝影顯微鏡(日本Nikon)、RM223 徠卡切片機(Leica Biosystems Nussloch Gmbh)、HI121 徠卡攤片機(Leica Biosystems Nussloch Gmbh) 、Adobe Photoshop 2020簡體中文版圖形處理軟件、電熱恒溫水浴鍋DK 98 Ⅱ(天津市泰斯特儀器有限公司)、高速萬能粉碎機(浙江省永康市溪岸五金藥具廠)、標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩(浙江上虞市華豐五金儀器有限公司)、AR124CN電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)、KH7200B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)、D28-2電磁爐(吳川市大昌電器有限公司)。

1.2 材料 石油醚(60～90 ℃，西隴科學(xué)股份有限公司)、氨水(AR，廣東光華科技股份有限公司)、氯仿(云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)滇池藥業(yè))、乙酸乙酯(AR，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)、甲酸(天津市風(fēng)船有限公司)、乙醇(AR，四川西隴科學(xué)有限公司)、95%乙醇(昆明遠(yuǎn)方生物制品有限公司)、無水乙醇(AR，昆明遠(yuǎn)方生物制品有限公司)、固綠FCF(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、臧紅T(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、切片石蠟(上海懿洋儀器有限公司)、蜂蠟(中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司)。其余試劑均為分析純。

本品采自昆明市西山區(qū)西山，中國科學(xué)院昆明植物研究所經(jīng)雷立公研究員鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物紅泡刺藤(RubusniveusThunberg.)的根。

2 方法

2.1 基源鑒別 原植物標(biāo)本送請中科院昆明植物所鑒定，根據(jù)標(biāo)本鑒定結(jié)果，描述植物形態(tài)并核對《中國植物志》。

2.2 性狀鑒定 觀察藥材的形狀、大小、顏色、表面特征、質(zhì)地、折斷面、氣味等外觀性狀特征進(jìn)行描述并拍攝藥材照片。

2.3 顯微鑒定 取新鮮藥材藥用部位(根部)切成完整厚度均勻的薄片進(jìn)行脫水(30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇→無水乙醇→無水乙醇→無水乙醇：TO(3∶1)→無水乙醇：TO(1∶1)→無水乙醇：TO(1∶3)→純TOⅠ→純TOⅡ→純石蠟Ⅰ→純石蠟Ⅱ)，按照常規(guī)石蠟制片方法制作石蠟切片，然后再進(jìn)行染色(純TOⅠ→純TOⅡ→95%乙醇→1%番紅→95%乙醇→無水乙醇Ⅰ→無水乙醇Ⅱ→無水乙醇Ⅲ→0.2%固綠→無水乙醇：TO(1∶3)→純TOⅠ→純TOⅡ)、封片。干藥材打粉過60目篩，制成粉末臨時裝片，利用顯微鏡觀察藥材的組織構(gòu)造、細(xì)胞形態(tài)等特征來，并描述分析。

2.4 理化鑒定 將藥材粗粉(過40目篩)，分別制備水提取液、乙醇提取液、酸性乙醇提取液、石油醚提取液，并按照天然藥物化學(xué)實驗指導(dǎo)中進(jìn)行化學(xué)成分的系統(tǒng)預(yù)試驗，初步得出藥材所含的各類成分、并對各類成分進(jìn)行薄層色譜試驗。

2.4.1 系統(tǒng)預(yù)實驗

2.4.1.1 水提取液 稱取黑鎖梅根(根)粗粉5 g，置于100 mL錐形瓶中，加蒸餾水50 mL浸泡放置過夜，過濾，濾出約20 mL的濾液，用于檢查氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)等化學(xué)成分。將剩下的濾渣同濾液于水浴60 ℃上熱浸30 min，然后趁熱過濾，濾渣舍去，濾液，用于檢查糖、多糖、有機酸、皂苷、苷類、酚類、鞣質(zhì)等化學(xué)成分。

2.4.1.2 乙醇提取液 稱取黑鎖梅根粗粉10 g，置于250 mL磨口三角燒瓶中，加入95%乙醇100 mL，于水浴上加熱回流1 h，稍冷后加入蒸餾水36 mL使其含醇量為70%，冷至室溫，過濾，濾渣舍去，濾液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用100 mL石油醚(60～90 ℃)萃取，分別萃取兩次，每次50 mL，上層液(石油醚)舍去，下層液(乙醇提取液)濃縮至40 mL，加95%乙醇50 mL溶解后過濾，濾液，用于檢查黃酮、蒽醌、香豆素、萜類、甾體化合物、內(nèi)酯類化合物、強心苷、有機酸、酚類、鞣質(zhì)等成分。

2.4.1.3 酸性乙醇提取液 稱取黑鎖梅根粗粉2 g，加0.5%的硫酸乙醇溶液10 mL，于水浴上加熱回流10 min，過濾，濾渣舍去，濾液，用于檢查生物堿類化學(xué)成分。

2.4.1.4 石油醚提取液 稱取黑鎖梅根粗粉1 g，加入石油醚(60～90 ℃)10 mL，室溫浸泡2～3 h，過濾，濾渣舍去，濾液用于檢查揮發(fā)油、油脂、萜類、甾體化合物等成分。

2.4.2 薄層色譜供試液的制備 稱取3個不同產(chǎn)地的黑鎖梅根粗粉5 g，置于磨口錐形瓶中，加95%乙醇50 mL，于水浴上加熱回流1 h，稍冷后加入蒸餾水18 mL使其含醇量為70%，冷至室溫，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中；用50 mL石油醚(60～90 ℃)分兩次萃取，每次用石油醚25 mL，以除去葉綠素等，分出下層乙醇提取液，濃縮至20 mL，加95%乙醇25 mL溶解后過濾，適當(dāng)超聲，濾液作為供試液。

3 結(jié)果

3.1 性狀鑒定 本品干燥根呈圓柱形，挺直或稍彎曲，長約70 cm ，直徑0.3～2.3 cm。表面黃棕色，有較密并深陷的細(xì)縱皺紋、排列稀疏的須根痕；質(zhì)地堅硬，不易折斷，斷面略平坦，皮部棕褐色，較厚，木部淡黃色，略呈放射狀，皮部與木部易剝離。氣微，味微甜。如圖1所示。

圖1 黑鎖梅根藥材圖

3.2 顯微鑒定

3.2.1 根橫切面 根橫切面呈類圓形，木栓層由10余列扁平細(xì)胞組成，有石細(xì)胞散在，外被落皮層。皮層狹窄，排列緊密。韌皮部寬廣，韌皮射線明顯，向外漸彎曲。形成層呈環(huán)狀排列。木質(zhì)部發(fā)達(dá)，木纖維排列成環(huán)，導(dǎo)管單個或數(shù)個成群存在，分布較密集，呈放射狀排列。薄壁細(xì)胞中含淀粉粒和草酸鈣方晶。如圖2 A、B、C所示。

A.全圖；B.簡圖；C.詳圖；1.木栓層；2.皮層；3.韌皮部；4.形成層；5.木質(zhì)部；6.射線；7.導(dǎo)管；8.草酸鈣方晶；9.石細(xì)胞圖2 黑鎖梅根(根)橫切面圖

3.2.2 粉末特征 本品粉末黃棕色。木栓細(xì)胞呈多角形，壁略增厚，含黃棕色色素。導(dǎo)管多為具緣紋孔導(dǎo)管，較大，直徑35～120 μm。纖維呈長梭形，單個散在或成束，壁厚2～15 μm，紋孔明顯，直徑10～35 μm。石細(xì)胞單個或成群存在，類方形、長方形或類圓形，壁厚2～8 μm。胞腔較大，紋孔明顯，直徑15～45 μm。淀粉粒類圓形、半圓形或不規(guī)則形，直徑2～12 μm，臍點點狀、短縫狀、人字形，層紋不明顯；復(fù)粒多見，由2～4分粒組成。草酸鈣方晶多，直徑5～18 μm。如圖3所示。

1.木栓細(xì)胞；2.導(dǎo)管；3.纖維；4.石細(xì)胞；5.淀粉粒；6.方晶圖3 黑鎖梅根(根)粉末特征圖

3.3 理化鑒定

3.3.1 主要化學(xué)成分 化學(xué)成分的系統(tǒng)預(yù)試驗結(jié)果顯示，黑鎖梅根含有多肽、蛋白質(zhì)、糖類、苷類、有機酸類、酚類化合物、鞣質(zhì)、黃酮類化合物、香豆素類、揮發(fā)油等成分。見表1～表5。

表1 黑鎖梅根冷水提取液化學(xué)成分預(yù)試結(jié)果

表2 黑鎖梅根熱水提取液化學(xué)成分預(yù)試結(jié)果

表3 黑鎖梅根乙醇提取液化學(xué)成分預(yù)試結(jié)果

表4 黑鎖梅根酸性乙醇提取液化學(xué)成分預(yù)試結(jié)果

表5 黑鎖梅根石油醚提取液化學(xué)成分預(yù)試結(jié)果

3.3.2 薄層色譜 分別吸取3個不同產(chǎn)地乙醇提取液4 μL，點于同一塊硅膠G薄層板上，乙酸乙酯：甲酸：水(12∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干后用10%硫酸乙醇溶液顯色后于105 ℃左右加熱數(shù)分鐘觀察，昆明市西山區(qū)碧雞鎮(zhèn)、尋甸回族彝族自治縣功山鎮(zhèn)、嵩明縣阿子營鄉(xiāng)3個不同產(chǎn)地黑鎖梅根藥材供試液在同一塊硅膠G板上的相同位置上顯現(xiàn)相同的斑點，且不同產(chǎn)地對應(yīng)的斑點顏色相同，重現(xiàn)性較好。如圖4所示。

1.嵩明縣阿子營鄉(xiāng)；2.昆明市西山區(qū)碧雞鎮(zhèn)；3.尋甸回族彝族自治縣功山鎮(zhèn)圖4 3個不同產(chǎn)地黑鎖梅根的薄層色譜圖

4 討論

本文通過對黑鎖梅根的來源、藥材性狀、顯微及理化鑒別的研究結(jié)果表明：黑鎖梅根橫切面及粉末鑒別特征明顯，可作為其真?zhèn)舞b別的專屬性特征?；瘜W(xué)成分豐富，薄層色譜重現(xiàn)性好，為進(jìn)一步的深入研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)。

在進(jìn)行薄層色譜試驗時，采用的是乙醇提取液作為供試液，分別以乙酸乙酯∶甲酸∶水(4∶1∶1)、乙酸乙酯∶甲酸∶水(8∶1∶1)、乙酸乙酯∶甲酸∶水(10∶1∶1)、乙酸乙酯∶甲酸∶水(12∶1∶1)等為展開劑展開，但最終以乙酸乙酯∶甲酸∶水(12∶1∶1)展開的成點性及重現(xiàn)性較好，其他比例的展開劑展開效果不佳，因所含成分復(fù)雜,拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，成點性不好。