HPLC法測定麗江山慈菇中秋水仙堿含量

黃云先 劉云懷 楊光榮

麗江市食品藥品檢驗所,云南 麗江 674100

麗江山慈菇是百合科植物山慈菇IphigeniaindicaKunth的鱗莖[1]，又名山慈菇、土貝母、草貝母、假貝母、鬧狗藥[2]、苦子、光苦子、益辟堅[3]、光慈菇[4]如圖1所示。云南省地方習(xí)用藥材，為納西族、白族、彝族常用藥材。載于《本草遺拾》，為《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》(1974年版、1996年版)、《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2005年版第二冊·彝族藥收載品種。與《中國藥典》2015年版一部收載“山慈菇”比較，來源系不同科屬植物，為與國家標(biāo)準(zhǔn)相區(qū)別，謂之“麗江山慈菇”，是云南產(chǎn)中成藥的“乳癖清膠囊(國藥準(zhǔn)字Z20025068)”的原料藥之一。麗江山慈菇還是提制秋水仙堿的主要原料?！对颇鲜≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》2005年版第二冊·彝族藥中對麗江山慈菇的性狀、鑒別、水分、酸不溶性灰分、浸出物有明確規(guī)定，但對其含量卻沒有測定方法，本文參照文獻(xiàn)[5-6]，通過對云南省麗江古城區(qū)和玉龍縣及大理4個批次的麗江山慈菇樣品進(jìn)行了秋水仙堿的含量測定，以建立一個合理的測定方法，從而達(dá)到控制麗江山慈菇藥材質(zhì)量的目的。

A.地上部分 B.球莖圖1 麗江山慈菇圖

1 儀器與試藥

安捷倫1260型高效液相色譜儀[二極管陣列檢測器，安捷倫(中國)科技有限公司]； Hubble C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm,OmniGene LLC)；BT224S電子分析天平(德國塞多利斯)； MS205DU電子分析天平(梅特勒Pur)； elab Flex 超純水機(英國ELGE)。

秋水仙堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：101176-201202，按93.6%計)；乙腈、甲醇[色譜純，美國塞默飛世爾科技(中國)有限公司]； 磷酸(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；水(實驗室自制UP水，Ω=18.3)。麗江山慈菇樣品購買、采集麗江古城區(qū)、玉龍縣及大理樣品共4個：L01，2015年8月，采自麗江市玉龍縣龍蟠鄉(xiāng)新文村，野生品，干燥花期全株；L02，2015年9月，采自麗江市古城區(qū)金山鄉(xiāng)東河村，野生品，干燥果期全株；L03，2015年9月，購自麗江市古城區(qū)象山市場，為大理州鶴慶縣野生品，干燥藥材球莖；L04，2015年10月，購自麗江市玉龍縣龍蟠鄉(xiāng)新文村藥農(nóng)嚴(yán)四軍，為其采挖的當(dāng)?shù)匾吧?，干燥藥材球莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜柱與系統(tǒng)適用性試驗 譜柱：Hubble C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-水(60∶40)為流動相，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL，檢測波長為254 nm，柱溫為30 ℃。理論板數(shù)按麗江山慈菇峰計不低于3000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取秋水仙堿對照品適量，加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL含26.133 μg的溶液，作為對照品液。色譜圖如圖2所示。

秋水仙堿對照品圖2 秋水仙堿對照品HPLC色譜圖

2.2.2 供試品溶液 取麗江山慈菇粉末(過四號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇25 mL，稱定重量。超聲(500 W，40kHz)處理30 min，放冷，再次稱定重量，用50%甲醇補足減失重量。濾過，濾液作為樣品溶液。如圖3所示。

秋水仙堿圖3 麗江山慈菇供試品HPLC色譜圖

2.3 線性關(guān)系 取秋水仙堿對照品13.96 mg，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含26.133、52.266、104.530、156.800、209.060、261.330、522.660 μg的一系列的對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定其峰面積，以對照品的濃度(X,μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，按外標(biāo)法進(jìn)行線性回歸，線性方程為Y=42.65537X-149.68159，r=0.999 7。說明秋水仙堿在26.133～522.660 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.4 精密度試驗 取26.133 μg·mL-1秋水仙堿對照品溶液10 μL，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積的RSD為0.3%(n=6)，表明該系統(tǒng)的精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗 取供試品溶液L01-1，按上述方法連續(xù)測定8次，測得峰面積RSD為0.6%(n=8)，表明供試品溶液重復(fù)性較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液L01-1，按含量測定方法測定9次，每次間隔約8 h，測得峰面積的RSD為1.1%(n=9)，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗 精密量取線性關(guān)系考察中儲備液1 mL至10 mL量瓶中、3 mL至25 mL量瓶中1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成含33.480、40.176、50.220 μg·mL-1的對照品溶液。分別取以上3個濃度秋水仙堿對照品以1∶1的比例加入已知含量L01-1、L01-2、L01-3中，按前述色譜條件測定?；厥章史謩e為96.7%，99.8%，102.3%，98.4%，98.7%，100.5%，99.3%，103.9%，99.6%，RSD=2.1%(n=9)。

2.8 樣品含量測定 取26.133 μg·mL-1的秋水仙堿對照品及各樣品按“2.2.2”方法制備的供試品溶液，進(jìn)行測定，按外標(biāo)法計算麗江山慈菇中秋水仙堿的含量。同一樣品平行測定2次，結(jié)果見表1。

表1 麗江山慈菇含量測定結(jié)果 (n=2)

3 討論

3.1 檢測波長的選定 以二極管陣列檢測器進(jìn)行全波長190～400 nm掃描，秋水仙堿對照品在254 nm、353 nm處有最大吸收，經(jīng)試驗確定采用254 nm作為檢測波長。理論板數(shù)按秋水仙堿峰計算不低于3000。

3.2 流動相的選擇 篩選了乙腈-甲醇(40∶60)、甲醇-水(55∶45)(60∶40)(65∶35)、甲醇-0.2%磷酸溶液(60∶40)(40∶60)六組流動相進(jìn)行考察，結(jié)果甲醇-水(60:40)分離效果好，峰形良好，且保留時間適中，故確定上述流動相系統(tǒng)為本法的流動相。

3.3 樣品提取溶劑選擇 取本品粉末(過四號篩)0.5 g或1 g，篩選了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、乙醇、50%乙醇、70%乙醇超聲(500 W，40 kHz)處理30 min、1 h、2 h或加熱回流30 min的方法分別進(jìn)行樣品提取，通過考察，取樣品0.5 g與1 g，樣品1 g峰面積較好且穩(wěn)定；加熱回流30 min與超聲(500 W，40 kHz)處理30 min結(jié)果相差不大；提取時間30 min與1 h、2 h后，提取率幾乎不變；使用50%的甲醇超聲處理30 min提取效率最高。故確定樣品提取方法為取本品粉末(過四號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇25 mL，稱定重量。超聲(500 W，40 kHz)處理30 min，放冷，再次稱定重量，用50%甲醇補足減失重量。濾過，濾液作為供試品溶液。此方法提取效率最高，且操作簡便。

4 結(jié)論

不同地區(qū)麗江山慈菇譜圖略有不同，但秋水仙堿確實都存在，可見以秋水仙堿作為麗江山慈菇藥材標(biāo)識性成分有其合理性。且本法簡便、快捷，準(zhǔn)確度高，專屬性強，重復(fù)性好，填補了以往麗江山慈菇含量測定的空白，可用于麗江山慈菇藥材的含量測定及質(zhì)量控制。經(jīng)試驗驗證，新擬HPLC法可行。按實際測得含量值，建議定麗江山慈菇按干燥品計，含秋水仙堿(C22H25NO6)不得少于0.12%。