延齡草多糖增強免疫作用研究

查雨鋒 詹 易 李 婷 顏 宏 黃加文 吳德松*

1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2. 云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室，云南 昆明 650111

免疫系統(tǒng)是機體自我保護的防御性結(jié)構(gòu)，它對人體的健康起著舉足輕重的作用，免疫系統(tǒng)的缺失或失調(diào)會引起自身免疫性疾病、病原體感染、腫瘤等病癥的發(fā)生。植物多糖是存在于生物體內(nèi)的一類生物大分子物質(zhì)，具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、促進機體免疫力等生物活性[1]，而免疫調(diào)節(jié)作用是其最重要的生物活性功能，一直是人們研究的熱點[2]。延齡草TrilliumtschonoskiiMaxim.為百合科延齡草屬植物，別名頭頂一顆珠、七葉一枝花、芋兒七等，主產(chǎn)于我國陜、鄂、川、湘等地。味甘，性平，有小毒，是傳統(tǒng)的名貴中藥，具有鎮(zhèn)靜安神、活血止血、解毒等功效[3]。藥理學研究[4-8]表明，延齡草提取物具有抗癌、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、凝血及免疫調(diào)節(jié)等作用。但截至目前，針對延齡草調(diào)節(jié)免疫作用研究的文獻報道較少，且文獻中所使用的實驗?zāi)Ｐ秃头椒ㄝ^為單一，另外，延齡草免疫調(diào)節(jié)作用與其成分中的多糖是否具有相關(guān)性也未見文獻報道。因此，本研究基于延齡草在免疫調(diào)節(jié)作用研究中的不足，對其多糖的特性免疫及非特異性進行全面研究，為延齡草多糖在免疫調(diào)節(jié)方面的藥理研究提供實驗依據(jù)，并為今后延齡草多糖免疫調(diào)節(jié)藥物、增強免疫力保健食品的開發(fā)提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品來源及制備 原植物經(jīng)云南省藥物研究所天然藥物資源研究室朱高倩博士鑒定為百合科多年生草本植物延齡草TrilliumtschonoskiiMaxim.。制備時，取延齡草干燥根莖粉末2.0 kg，用95%乙醇回流提取，取藥渣，用熱水回流提取3次，濾過，合并提取液離心，取離心液放入有機膜設(shè)備中，用超濾膜過濾(M>10000Da)后，濾液再過納濾有機膜(10000Da>M>300Da)，取未過納濾膜成分，用4倍量的95%乙醇醇沉，4 ℃過夜后離心，取沉淀凍干即得103.2 g延齡草多糖，得率為5.16%。采用苯酚-硫酸法測得多糖含量為64.1%。

1.1.2 實驗動物 SPF級KM小鼠，體重為18～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2020-0004。

1.1.3 主要試劑 二硝基氟苯，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：68XJB-MT；綿羊紅細胞，北京索萊寶科技有限公司，批號：20200911；3,3′-[1-(苯氨?；?-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉(XTT鈉鹽)，北京索萊寶科技有限公司，批號：C10898415；刀豆蛋白A(ConA)，北京索萊寶科技有限公司，批號：109R031； RPMI1640培養(yǎng)液，Gibco公司，批號：8120199；胎牛血清，Gibco公司，批號：1993361；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號：20201105。

1.1.4 主要儀器 SQP電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；JJ2000型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；AC2-6S1型二級生物安全柜，新加坡ESCO公司；CCL-170A-8型CO2恒溫培養(yǎng)箱，新加坡ESCO公司；3H12RI型高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；DMIL-LED型倒置相差顯微鏡，德國萊卡公司；GNP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Multiskan GO全波長酶標儀，ThermoFisherScientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠急性毒性試驗 參照文獻[9-10]方法，取40只KM小鼠，雌雄各半，稱重后隨機分為兩組，即溶媒對照組和受試樣品組。用純水將受試樣品配制成利于小鼠灌胃的最大濃度(135.0 g/L)，小鼠禁食不禁水12 h，采用最大給藥量法在24 h內(nèi)按40 mL/kg的給藥體積3次灌胃給予受試樣品，給藥間隔4 h，給藥后觀察小鼠狀態(tài)、體重變化、毒性反應(yīng)和死亡等情況，并連續(xù)觀察14 d。對實驗期死亡動物以及結(jié)束期處死動物進行解剖，觀察動物內(nèi)臟器官的體積、顏色、質(zhì)地等有無明顯異常。

1.2.2 對小鼠免疫器官的影響 參考相關(guān)文獻[11-14]發(fā)現(xiàn)，大多植物多糖在100～500 mg/kg劑量范圍內(nèi)具有明顯的免疫促進作用，因此本研究以此作為參考設(shè)定延齡草多糖的小鼠給藥劑量。取48只雄性KM小鼠，隨機分為4組，每組12只動物，即溶媒對照組、延齡草多糖100、200、400 mg/kg劑量組。延齡草多糖各劑量組按20 mL/kg給藥體積灌胃給藥，連續(xù)給藥14 d，溶媒對照組給予純水。于給藥后第14天稱重動物，處死后將其胸腺和脾臟分離出并稱重，計算胸腺/體重和脾臟/體重比重[15-16]。

1.2.3 對小鼠細胞免疫的影響

1.2.3.1 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗 動物分組及給藥情況同“1.2.2項”， 參照文獻[15-16]方法，于給藥后第7天，用二硝基氟苯溶液涂抹于小鼠腹部誘導致敏，于給藥后第14天，用10 μL二硝基氟苯溶液均勻涂抹于小鼠右耳進行激發(fā)。激發(fā)24 h后處死小鼠，剪下左右耳。用打孔器取下直徑8 mm的耳片，稱重，用左右耳重量之差表示遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的程度。

1.2.3.2 ConA誘導脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗 動物分組及給藥情況同“1.2.2項”，在末次給藥1 h后處死各組動物，無菌條件下分離脾臟，制備成單個脾細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度。將脾細胞培養(yǎng)于24孔板中，并加入ConA進行誘導，對照組則加入相同體積的空白培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中孵育72 h。采用XTT法測定各孔脾淋巴細胞增殖活性[15-16]。

1.2.4 對小鼠體液免疫的影響

1.2.4.1 血清溶血素生成實驗 動物分組及給藥情況同“1.2.2項”，于給藥后第7天，腹腔注射2%(V/V)的綿羊紅細胞對小鼠進行免疫誘導，于第14天取血分離血清。用生理鹽水將血清進行倍比稀釋，布于96孔U型板內(nèi)并加入0.5%(V/V)的綿羊紅細胞，37 ℃孵育4 h，觀察紅細胞凝集程度，計算抗體(血清溶血素)積數(shù)[15-16]。

1.2.4.2 抗體生成細胞檢測 動物分組及給藥情況同“1.2.2項”，于給藥后第7天，每只小鼠腹腔注射綿羊紅細胞進行免疫誘導，于給藥后第14天處死動物，無菌條件下分離脾臟，制備成單個脾細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×106個細胞/mL。取50 μL綿羊紅細胞、200 μL脾細胞懸液加入試管中(內(nèi)含0.5 mL濃度為5 mg/mL的瓊脂糖)，倒入包被瓊脂糖的6孔板中混合均勻，每個樣本做兩個平行孔。放入培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后每孔加入500 μL補體，繼續(xù)孵育2 h，計數(shù)溶血空斑數(shù)，結(jié)果以空斑數(shù)/106脾細胞表示[15-16]。

1.2.5 對小鼠單核-巨噬細胞吞噬能力的影響 動物分組及給藥情況同“1.2.2項”，各組動物于給藥后第14天稱重，尾靜脈注射印度墨汁溶液。注入墨汁后2、10 min從內(nèi)眥靜脈叢取20 μL全血，并立即加到 2 mL 0.1% Na2CO3溶液中。以Na2CO3溶液作空白對照，在600 nm波長處測吸光度值，處死動物并分離肝臟和脾臟進行稱重，以吞噬指數(shù)a表示小鼠單核-巨噬細胞吞噬能力[15-16]。

1.2.6 對NK細胞活性的影響 動物分組及給藥情況同“1.2.2項”。在末次給藥1 h后處死各組動物，無菌條件下分離脾臟，制備成單個脾細胞懸液，并與小鼠淋巴瘤細胞(YAC-1細胞)按50:1的比例共培養(yǎng)于96孔U型板中。以單獨培養(yǎng)的YAC-1細胞作為自然釋放孔，在YAC-1細胞單獨培養(yǎng)孔中加入2.5%Triton裂解液作為最大釋放孔，孵育4 h后，采用LDH試劑盒測定各孔上清吸光度值，并計算NK細胞活性[15-16]。

2 結(jié)果

2.1 小鼠急性毒性試驗 溶媒對照組所有動物給予純水后一般狀況良好，未見明顯毒性反應(yīng)。小鼠灌胃給予延齡草多糖后連續(xù)觀察4 h內(nèi)以及觀察期14 d內(nèi)，所有動物均未見明顯毒性反應(yīng)。各組動物給藥后體重均持續(xù)增長，與溶媒對照組比較，延齡草多糖組動物體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。觀察結(jié)束后脫臼頸椎處死動物并進行大體解剖觀察，所有小鼠各組織、器官均未見明顯異常。延齡草多糖對小鼠經(jīng)口急性毒性試驗的最大給藥量為16.2 g/kg。結(jié)果見表1、表2。

表1 延齡草多糖小鼠灌胃給藥急性毒試驗動物毒性反應(yīng)及死亡情況

表2 延齡草多糖小鼠灌胃急性毒性試驗動物體重變化情況

2.2 延齡草多糖對小鼠免疫器官的影響 與溶媒對照組比，延齡草多糖各劑量組對小鼠脾臟/體重比值和胸腺/體重比值均無明顯影響(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 延齡草多糖對小鼠免疫器官的影響

2.3 延齡草多糖對小鼠細胞免疫的影響 結(jié)果顯示，與溶媒對照組比較，延齡草多糖200、400 mg/kg劑量組均能明顯升高小鼠耳廓腫脹度，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，延齡草多糖100、200、400 mg/kg劑量組均能明顯升高小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化活性，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 延齡草多糖對小鼠細胞免疫的影響

2.4 延齡草多糖對小鼠體液免疫的影響 結(jié)果顯示，與溶媒對照組比較，延齡草多糖100、200、400 mg/kg劑量組均能明顯升高小鼠血清中的抗體積數(shù)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，延齡草多糖400 mg/kg劑量組能明顯升高溶血空斑數(shù)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見表5。

表5 延齡草多糖對小鼠體液免疫的影響

2.5 延齡草多糖對小鼠單核-巨噬細胞吞噬能力及NK細胞活性的影響 結(jié)果顯示，與溶媒對照組比較，延齡草多糖200、400 mg/kg劑量組均能明顯升高小鼠NK細胞活性，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但各劑量組對小鼠碳廓清吞噬指數(shù)均無明顯影響，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見表6。

表6 延齡草多糖對小鼠單核-巨噬細胞吞噬能力及NK細胞活性的影響

3 討論

隨著分子生物學、細胞生物學等相關(guān)學科的不斷發(fā)展，人們對多糖的研究也不斷深入，多糖生物學已成為國際爭奪生物化學研究領(lǐng)域的制高點，是繼蛋白質(zhì)、基因工程后生物化學和分子生物學領(lǐng)域中的前沿科學[17]。而植物多糖作為眾多糖中的成分之一，參與細胞的各種生理活動，具有多種藥理活性及生理作用，是極具發(fā)展?jié)摿Φ馁Y源之一。免疫調(diào)節(jié)是眾多植物多糖中較為普遍和重要的生物活性，而且植物多糖對機體的免疫調(diào)節(jié)作用往往是正向調(diào)節(jié)。目前，在已提取得到的300多種植物多糖中，有100余種多糖具有免疫促進作用[18]。研究[19]表明，植物多糖可激活T/B淋巴細胞、NK細胞、巨噬細胞等免疫細胞，促進抗體生成和多種細胞因子的釋放，激活補體系統(tǒng)等調(diào)節(jié)機體免疫力。根據(jù)植物多糖的免疫促進作用，可將其開發(fā)為免疫制劑，用于免疫力低下的治療，或用于腫瘤免疫治療，亦可作為增強免疫力保健食品的重要原料。延齡草多糖同屬植物多糖，其免疫調(diào)節(jié)作用同樣具有進一步研究和開發(fā)價值。

免疫反應(yīng)是機體的一種自我防御形式，良好的免疫力是保證身體健康的根本起點，免疫器官、免疫細胞和免疫分子共同組成了人體的免疫系統(tǒng)，他們之間相互協(xié)調(diào)和配合完成了機體的特異性免疫和非特異性免疫，體液免疫和細胞免疫屬于特異性免疫，而單核-巨噬細胞吞噬和NK細胞活性屬于非特異性免疫。本研究通過全面考察延齡草多糖對小鼠特異性免疫及非特異性免疫的作用，以闡明其是否具有免疫增強作用及其免疫調(diào)節(jié)作用的特點。本研究發(fā)現(xiàn)，延齡草多糖可明顯加重小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的程度，升高脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化活性，提高小鼠抗體細胞的生成和血清中的抗體積數(shù)，表明延齡草多糖可通過調(diào)節(jié)細胞免疫和體液免疫而發(fā)揮增強免疫的作用。此外，延齡草多糖還能明顯提高小鼠NK細胞的活性，但其對小鼠碳廓清吞噬指數(shù)無明顯影響，表明延齡草多糖可通過部分調(diào)節(jié)非特異性免疫而發(fā)揮免疫增強作用。

胸腺和脾臟是哺乳動物機體中重要的免疫器官，其發(fā)育狀況與機體免疫能力的高低有著直接的關(guān)系，胸腺和脾臟指數(shù)反映了免疫器官的發(fā)育和免疫功能[20]。本研究結(jié)果顯示，延齡草多糖雖然對小鼠脾臟/體重比值、胸腺/體重比值無顯著促進作用(P>0.05)，但具有增加小鼠脾臟/體重比值、胸腺/體重比值的趨勢，且具有一定的劑量依賴性。

小鼠灌胃急性毒性試驗結(jié)果顯示，延齡草多糖的最大給藥量為16.2 g·kg-1，且試驗中未觀察到實驗動物出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，小鼠各組織、器官也未發(fā)現(xiàn)明顯異常，表明延齡草多糖對小鼠毒副作用較小，其安全性較好。

綜上所述，延齡草多糖可通過調(diào)節(jié)小鼠細胞免疫、體液免疫及NK細胞活性，從而達到增強免疫力的作用，具有進一步研究和開發(fā)的價值，為今后延齡草多糖免疫調(diào)節(jié)藥物、增強免疫力保健食品的開發(fā)提供了實驗依據(jù)。