固本平喘方納米脂質(zhì)體霧化吸入劑改善哮喘豚鼠病理狀態(tài)的研究

貫 劍 宋紅普 張曉曉 張 彤

1.河南省商丘市梁園區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，河南 商丘 476000；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 200030；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062

固本平喘方具有益氣平喘、脫敏解毒的功效,筆者在臨床上長期使用霧化吸入劑治療哮喘有較好效果，但方式多為簡單的霧化吸入，多數(shù)臨床觀察[1-3]僅停留在經(jīng)驗層面，實驗研究的機理不明確，本項研究，通過動物實驗來客觀地觀察和評價其治療效果，探討其在細胞的作用機理。

1 實驗材料

1.1 藥物

1.1.1 治療用藥 固本平喘霧化吸入劑(以下簡稱固本平喘方)：每毫升含1 g生藥量，由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供。

1.1.2 陽性對照藥 小青龍合劑(湖北福廣制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z42021495)。功能主治是解表化飲，止咳平喘,用于風(fēng)寒水飲，惡寒發(fā)熱，無汗，喘咳痰稀。每支裝10 mL。

1.2 實驗動物 英國種普通級健康豚鼠39只，體重250～300 g,均由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，普通級，實驗動物合格證號[上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SYXK(滬)2004-0005]。

1.3 設(shè)備與試劑

1.3.1 設(shè)備 貝爾思超聲霧化器(BSW-2A型)由鞍山市貝爾思電子有限公司生產(chǎn)。希森美康(XE-2100)全自動血球分析裝置，由日本SYSMEX CORPORATIION公司生產(chǎn)。萊卡SP1600切片機由上海萊卡儀器有限公司生產(chǎn)。奧林巴斯CX31顯微鏡。隔水式恒溫箱(PYX-DHS型)上海躍進醫(yī)療器械一廠生產(chǎn)。

1.3.2 試劑 卵蛋白粉(OVA )，國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)(批號：F20110811)。

2 實驗方法

2.1 造模方法 將豚鼠正常飼養(yǎng)1周后開始進行致敏。第1天，先用75%乙醇溶液消毒局部皮膚后, 給哮喘模型組、高劑量組、低劑量組及中藥對照組、西藥對照組每只豚鼠腹腔注射10%卵蛋白生理鹽水溶液1.6 mL(6 mL/kg，另有0.1 mL損耗)致敏。空白對照組用0.9%生理鹽水。第8天，再次注射致敏，各組劑量和方法同前。

2.2 模型評價指標(biāo) 第14天開始激發(fā)引喘，將豚鼠置于4 L 的玻璃鐘罩內(nèi)用1%卵蛋白霧化吸入15～30 s，觀察20～30 s，誘發(fā)哮喘發(fā)作(說明模型成功)。如豚鼠出現(xiàn)抽搐, 馬上將其取出。以后隔天進行1次引喘，至實驗結(jié)束。同時，從第14天起，引喘后1 h各組進行相應(yīng)治療。至第28天，各組動物處死，提取樣本。

2.3 分組與治療方法 A正常對照組：致敏、激發(fā)以及治療均以0.9%生理鹽水代替。B哮喘模型組：造模成功后每天吸入1%OVA溶液激發(fā)1次。C中藥對照組：霧化吸入小青龍合劑1 g/次。D固本平喘吸入劑小劑量組：霧化吸入劑1 g/次。E固本平喘吸入劑大劑量組：霧化吸入劑3 g/次。F西藥對照組：霧化吸入地塞米松1 g/次。

2.4 血常規(guī)檢測 采用全自動血球分析裝置自動分析血常規(guī)全套。

2.5 肺組織病理學(xué)檢查 各組豚鼠分別于末次激發(fā)后24 h內(nèi)用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉下開胸。取右肺下葉組織，置4%甲醛固定，24 h后酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片行HE染色，光鏡下觀察支氣管周圍炎性病變。

2.5.1 肺組織切片制備 ①切取標(biāo)本同一部位組織，大小約2 mm×1 mm×1 mm;②以乙醇進行梯度脫水(80%乙醇1次、95%乙醇2次、100%乙醇3次);③浸二甲苯2次，以透明;④用58 ℃低熔點石蠟浸蠟2次;⑤包埋蠟塊;⑥5 um常規(guī)切片，裱于防脫片劑處理過的干凈載玻片上;⑦置60 ℃恒溫箱中烤片3 h，備用。

2.5.2 肺組織HE染色 ①切片以二甲苯脫蠟2次;②以乙醇進行梯度脫水(100%乙醇3次、95%乙醇2次、80%乙醇1次);③在蒸餾水中停留2 min后，以蘇木素溶液染細胞核;④自來水沖洗，去掉浮色;⑤1%鹽酸酒精分化;⑥蒸餾水漂洗后，以1%伊紅酒精溶液染細胞質(zhì);⑦以乙醇進行梯度脫水(80%乙醇1次、95%乙醇2次、100%乙醇3次);⑧以二甲苯透明，樹脂膠封片。光鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 一般情況變化 各組在被激發(fā)后癥狀表現(xiàn)不同，正常對照A組豚鼠表現(xiàn)精神活躍、反應(yīng)靈敏、呼吸平穩(wěn)，無明顯呼吸急促、困難和喘鳴音，模型組合各用藥組豚鼠在吸入OVA后不久出現(xiàn)躁動、搔抓顏面等情況，部分豚鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹式呼吸，甚至哮鳴音等。在末次激發(fā)時，小劑量治療D組豚鼠未出現(xiàn)哮鳴音和呼吸困難，其他各治療組均有2～3只豚鼠出現(xiàn)輕度呼吸急促、喘鳴等情況。

3.2 血常規(guī)變化 模型組與其他組比較，WBC、EO水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。正常組較其他各組的EO水平均低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。D、E、F組的BA水平與模型組比較顯著增高，D、F組與C組比較亦有差異。A組與B組的PMN差別有統(tǒng)計意義，其余各組無差別。B組與A組比較，LY有顯著差別，D、E、F組與B組的差別也有統(tǒng)計學(xué)意義。詳見表1。

表1 固本平喘方對哮喘豚鼠血常規(guī)的影響

表1 固本平喘方對哮喘豚鼠血常規(guī)的影響

組別nWBCEOBAPMNLy正常對照A75.10±2.54△0.04±0.06△0.11± 0.041.15±0.512.78± 1.33哮喘模型B610.15±2.270.15 ±0.03*0.37± 0.16*1.76 ±0.48*5.41 ±1.95*中藥對照C65.90±2.32△0.10 ±0.03*△0.34 ±0.17*1.29 ±0.224.08 ±1.15小劑量治療D85.62±3.28△0.10 ±0.03*△0.16± 0.07△#1.37 ±0.403.26 ±1.47△大劑量治療E65.25±1.65△0.10 ±0.01*△0.21 ±0.10△1.36 ±0.393.59 ±1.30△西藥對照F65.52±1.09△0.09 ±0.01△*0.19 ±0.11△#1.23± 0.653.47 ±1.82△

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，△P<0.05;與C組比較，#P<0.05。

3.3 固本喘方對病理學(xué)的影響 肺組織病理學(xué)觀察變化情況，A正常對照組：支氣管及周圍肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺動脈壁輕度增厚,有2例伴有輕度間質(zhì)性肺炎。B哮喘模型組：肺動脈壁增厚，細支氣管腔內(nèi)充滿炎性分泌物,有2例伴有肺間質(zhì)纖維組織增生。C中藥對照組：肺內(nèi)細支氣管壁及管周見少量炎細胞浸潤，腔內(nèi)少量分泌物。小灶性肺組織結(jié)構(gòu)破壞，伴部分肉芽組織增生。D固本平喘吸入劑?。悍蝿用}壁增厚，細支氣管腔內(nèi)少量分泌物，3例出現(xiàn)輕度間質(zhì)性肺炎和局部間質(zhì)性肺炎。E固本平喘吸入劑大：1肺動脈壁增厚，輕度間質(zhì)性肺炎。2例出現(xiàn)局部肺組織破壞，伴肉芽組織增生。F西藥對照組：肺動脈壁增厚，輕度間質(zhì)性肺炎。2例出現(xiàn)肺組織結(jié)構(gòu)破壞，另有1例局部肺出血。A組：圖①、②；B組：圖③、④;C組：圖⑤、⑥;D組：圖⑦、⑧;E組：圖⑨、⑩;F組：圖、(如下圖所示)。

圖1 各組病理學(xué)改變比較圖

4 討論

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，反復(fù)接觸過敏原導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)性炎癥是多數(shù)哮喘發(fā)作的基本機制。中藥復(fù)方固本平喘方(包括黃芪、白術(shù)、黃芩、甘草、麻黃、烏梅等)是臨床經(jīng)驗方基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代研究進展優(yōu)化配伍而成，具有益氣平喘、脫敏解毒的功效。中藥霧化吸入劑治療哮喘有較好效果，但方式多為簡單的霧化吸入，多數(shù)臨床觀察僅停留在經(jīng)驗層面，實驗研究的機理不明確。

白細胞(WBC)升高是細菌性炎癥的主要表現(xiàn)，但是在哮喘動物實驗中也發(fā)現(xiàn)存在外周血WBC 增高的情況，有研究[4]表明中藥復(fù)方能顯著降低大鼠外周血WBC，較模型組有顯著差異 。哮喘炎癥的特征性標(biāo)志是嗜酸性細胞(EOS) 的浸潤，EOS細胞漿中含有嗜酸性細胞陽離子蛋白(ECP)、堿性蛋白(MBP)、嗜酸細胞衍生的神經(jīng)毒素(EDN)、嗜酸細胞過氧化物酶(EPO)等特殊蛋白質(zhì)顆粒以及多種炎癥介質(zhì)、細胞因子和氧自由基，EOS釋放組胺，產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性(AHR)，因此EOS是引起遲發(fā)相變態(tài)反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性的關(guān)鍵細胞，在介導(dǎo)氣道變應(yīng)性炎癥參與支氣管哮喘發(fā)病的調(diào)節(jié)中起重要作用[5]。同時，EOS 在氣道的緩解期也處于高水平，與晚期哮喘反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性關(guān)系密切[6]。淋巴細胞(LY)包括T淋巴細胞和B淋巴細胞，EOS分化、成熟、聚集又依賴于淋巴細胞的活化及其產(chǎn)生的細胞因子來調(diào)節(jié)，因此淋巴細胞在哮喘發(fā)病中也起了關(guān)鍵作用，它影響哮喘的發(fā)生和哮喘氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性，其中T淋巴細胞具有“中樞性”調(diào)節(jié)作用[7]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，模型組與其他組比較WBC、EO水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明模型組的血液中EO增多，處于一種致敏狀態(tài)。正常組較其他各組的EO水平均低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。B組與A組比較，LY有顯著差別，D、E、F組與B組的差別也有統(tǒng)計學(xué)意義，提示造模后的豚鼠LY明顯升高，而兩個治療組和西藥組對于豚鼠外周血的LY有降低作用。

從各組的病理結(jié)果可以看出，正常組由于霧化等因素影響，存在肺動脈壁增厚和輕微炎癥的情況。哮喘模型組的炎癥情況最為嚴(yán)重，動脈壁增厚。中藥對照組炎癥情況減輕，伴有肉芽組織增生。兩組治療組同樣有肺動脈增厚，并有輕度炎癥存在。西藥組存在肺組織結(jié)構(gòu)受到破壞的情況，以上不排除外界感染的可能。