柱前衍生HPLC法測(cè)定硫酸阿米卡星及其制劑中基因毒性雜質(zhì)肼的研究

姚永青 杜斌

(1 鄭州大學(xué)，鄭州 450001；2 河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州 450018)

硫酸阿米卡星為半合成氨基糖苷類(lèi)抗生素[1-2]，1957年HamaoUmezawa發(fā)現(xiàn)，1972年日本Bristol公司研究成功，我國(guó)1981年開(kāi)始生產(chǎn)。硫酸阿米卡星屬靜止期殺菌劑，適用于銅綠假單胞菌等敏感革蘭陰性桿菌與葡萄球菌屬(甲氧西林敏感株)所致嚴(yán)重感染，尤其適用于治療革蘭陰性桿菌對(duì)卡那霉素、慶大霉素或妥布霉素耐藥菌株所致的嚴(yán)重感染，其制劑為注射劑，為國(guó)家基本藥物目錄收載品種，在臨床中應(yīng)用廣泛。

基因毒性雜質(zhì)是指對(duì)DNA具有直接或間接的破壞性，產(chǎn)生基因突變或體內(nèi)誘變，而具有致癌可能或者傾向的雜質(zhì)，其毒性很強(qiáng)，常常在很低的含量或濃度水平下，即可對(duì)人體造成遺傳物質(zhì)的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致基因突變促使腫瘤的發(fā)生[3-4]。阿米卡星為卡那霉素等經(jīng)硅烷化、酯化、酰化、水解、肼解反應(yīng)后純化制得，在?；a(chǎn)物水解液的肼解反應(yīng)中使用了水合肼，肼具有基因毒性結(jié)構(gòu)，是一種已知的基因毒性雜質(zhì)，具有潛在的致癌性，肼主要通過(guò)代謝活化生成碳正離子和碳氧自由基等活性較強(qiáng)的中間體，與DNA發(fā)生烷基化反應(yīng)或?qū)е翫NA其他病變[5-6]。ICH M7指出肼在體內(nèi)和體外均具有致突變性和遺傳毒性，肼被IARC(國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu))列為2B類(lèi)，對(duì)人類(lèi)可能致癌，EPA(環(huán)境保護(hù)局)認(rèn)為肼是B2類(lèi)致癌物或人類(lèi)可能的致癌物質(zhì)。

本研究選取國(guó)內(nèi)硫酸阿米卡星原料及制劑和參比制劑，參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]建立柱前衍生HPLC法對(duì)硫酸阿米卡星及其制劑中的肼進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)可為其他藥物中肼的控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

1260高效液相色譜儀(Agilent)；XPE205電子天平(Mettler Toledo儀器上海有限公司)。

甲酸、苯甲醛、甲醇及乙腈均為色譜純，水為Mill-Q去離子水。

1.2 樣品

硫酸肼(批號(hào)W06E026，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%)購(gòu)自Alfa Aesar公司。硫酸阿米卡星6批次，來(lái)自國(guó)內(nèi)3家企業(yè)(A、B、C)；國(guó)內(nèi)硫酸阿米卡星注射液9批次，規(guī)格2 mL：200 mg，來(lái)自國(guó)內(nèi)3家企業(yè)(D、E、F)；國(guó)內(nèi)注射用硫酸阿米卡星8批次，規(guī)格200 mg，來(lái)自國(guó)內(nèi)3家生產(chǎn)企業(yè)(E、G、H)；硫酸阿米卡星注射液和注射用硫酸阿米卡星參比制劑各1批次，均購(gòu)自日本Nichiiko Pharmaceutical Co.Ltd。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zobax Eclipse XDB-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，5 μm )；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，按表1進(jìn)行線性梯度洗脫；流速1.0 mL/min；DAD紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量20 μL。

表1 線性梯度洗脫程序Tab.1 Linear gradient elution program

2.2 溶液的配制

2.2.1 苯甲醛溶液

取苯甲醛5 mL，用甲醇稀釋至100 mL，即得。

2.2.2 空白溶液

精密量取水1 mL，置10 mL離心管中，精密加苯甲醛溶液1 mL，振搖1 min，再精密加水5 mL，振搖1 h，濾過(guò)，即得。

2.2.3 空白輔料溶液

精密稱(chēng)取處方量輔料，置20 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL離心管中，精密加苯甲醛溶液1 mL，振搖1 min，再精密加水5 mL，振搖1 h，濾過(guò)，即得。

2.2.4 肼系列標(biāo)準(zhǔn)溶液

精密稱(chēng)取硫酸肼0.1030 g，置100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為肼貯備液。精密量取該貯備液，分別加水逐級(jí)稀釋并制成濃度為0.5022、1.2554、2.5109、5.0217和12.5543 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。分別精密量取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液1 mL，分別置10 mL離心管中，精密加苯甲醛溶液1 mL，振搖1 min，再精密加水5 mL，振搖1 h，濾過(guò)，即得。

2.2.5 供試品溶液

取硫酸阿米卡星、注射用硫酸阿米卡星約0.28 g，精密稱(chēng)定，置20 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，分別作為硫酸阿米卡星與注射用硫酸阿米卡星樣品溶液；取硫酸阿米卡星注射液過(guò)濾即為硫酸阿米卡星注射液的樣品溶液。精密量取各樣品溶液的續(xù)濾液1 mL，置10 mL離心管中，精密加苯甲醛溶液1 mL，振搖1 min，再精密加水5 mL，振搖1 h，濾過(guò)，即得。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 專(zhuān)屬性

分別精密量取“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)下的溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果空白溶劑和空白輔料均不干擾肼的測(cè)定，見(jiàn)圖1A與圖1B。

3.2 線性與范圍

精密量取“2.2.4”項(xiàng)下的肼系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，肼濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程Y=100.67X+10.778(r=0.9994)，表明肼在0.5022～12.5543 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好，典型色譜圖見(jiàn)圖1C。

3.3 準(zhǔn)確度

取硫酸阿米卡星(A企業(yè)，批號(hào)RA0078A)、注射用硫酸阿米卡星(E企業(yè)，批號(hào)1905244)、硫酸阿米卡星注射液(F企業(yè)，批號(hào)181202011)按“2.2.5”方法制備樣品溶液，分別精密量取樣品溶液1 mL，各9份，分別精密加入“2.2.4”項(xiàng)下1.2554 μg/mL的溶液1 mL、2.5109 μg/mL的溶液1 mL、2.5109 μg/mL的溶液1.5 mL，各3份，分別置10 mL離心管中，精密加苯甲醛溶液1 mL，振搖1 min，再精密加水，振搖1 h，濾過(guò)。取續(xù)濾液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。用“3.2”項(xiàng)下線性回歸方程計(jì)算樣品中肼的含量并計(jì)算回收率。結(jié)果硫酸阿米卡星、注射用硫酸阿米卡星與硫酸阿米卡星注射液中肼的平均回收率分別為94.8%、94.1%和94.3%，RSD(n=9)分別為5.1%、5.8%和4.0%，表明該方法回收率良好，見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the recovery tests

3.4 重復(fù)性

取硫酸阿米卡星(B企業(yè)，批號(hào)YA1903024)、注射用硫酸阿米卡星(H企業(yè)，批號(hào)1903031)、硫酸阿米卡星注射液(F企業(yè)，批號(hào)181202011)按“2.2.5”方法制備供試品溶液，各6份，取續(xù)濾液進(jìn)樣分析。用“3.2”項(xiàng)下線性回歸方程計(jì)算，結(jié)果硫酸阿米卡星、注射用硫酸阿米卡星與硫酸阿米卡星注射液中肼含量(mg/kg)的RSD分別為3.9%、3.4%和2.6%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

3.5 精密度

精密量取“2.2.4”項(xiàng)下2.5109 μg/mL肼標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果肼的峰面積RSD為1.2%，表明儀器精密度良好。

3.6 檢測(cè)限與定量限

分別精密量取“2.2.4”項(xiàng)下0.5022 μg/mL肼標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液1 mL，分別置50 mL和100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，分別作為檢測(cè)限溶液和定量限溶液。分別精密量取檢測(cè)限溶液和定量限溶液1 mL，置10 mL離心管中，精密加苯甲醛溶液1 mL，振搖1 min，再精密加水5 mL，振搖1 h，濾過(guò)。取續(xù)濾液進(jìn)樣分析，以信噪比(S/N)為3:1計(jì)，檢測(cè)限為0.1 ng，最低檢測(cè)濃度為0.05 μg/g(供試品溶液濃度為0.1 g/mL)；以信噪比(S/N)為10:1計(jì)，定量限為0.2 ng，最低定量濃度為0.1 μg/g(供試品溶液濃度為0.1 g/mL)。

3.7 溶液穩(wěn)定性

精密量取“2.2.4”項(xiàng)下2.5109 μg/mL肼標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別于0、2、4、8、10、12、18和24 h內(nèi)進(jìn)樣，結(jié)果肼峰面積的RSD為0.6%，表明肼對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 耐用性

3.8.1 衍生化反應(yīng)溫度

精密量取5份2.5109 μg/mL的肼標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，各1 mL，分別置10 mL離心管中，精密加苯甲醛溶液1 mL，振搖1 min，再精密加水5 mL，反應(yīng)溫度分別為25℃、28℃、30℃、32℃和35℃，振搖1 h，濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣分析，結(jié)果肼的峰面積RSD為0.9%。

3.8.2 衍生化試劑濃度

精密量取3份2.5109 μg/mL的肼標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，各1 mL，分別置10 mL離心管中，分別精密加4.8%、5.0%和5.2%苯甲醛甲醇溶液1 mL，振搖1 min，再精密加水5 mL，振搖1 h，濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣分析，結(jié)果肼的峰面積RSD為1.2%。

3.8.3 衍生化反應(yīng)時(shí)間

精密量取3份2.5109 μg/mL的肼標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，各1 mL，分別置10 mL離心管中，分別精密加苯甲醛溶液1 mL，振搖1 min，再精密加水5 mL，分別振搖55、60和65min，濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣分析，結(jié)果肼的峰面積RSD為0.8%。

3.8.4 小結(jié)

試驗(yàn)表明，衍生化反應(yīng)溫度、反應(yīng)濃度和反應(yīng)時(shí)間的微小變化均不影響測(cè)定結(jié)果，衍生化反應(yīng)方法耐用性良好。

3.9 樣品測(cè)定

取硫酸阿米卡星、注射用硫酸阿米卡星、硫酸阿米卡星注射液，分別按“2.2.5”方法制備供試品溶液，取續(xù)濾液進(jìn)樣分析。用“3.2”項(xiàng)下線性回歸方程計(jì)算樣品中肼的含量。結(jié)果國(guó)內(nèi)企業(yè)硫酸阿米卡星、注射用硫酸阿米卡星、硫酸阿米卡星注射液中的肼分別為未檢出～1.8 μg/g、未檢出～0.2 μg/g、未檢出～3.1 μg/g；日本Nichiiko公司的參比制劑中均未檢出肼，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of the sample determination

4 討論

4.1 柱前衍生HPLC方法的建立

肼極性大，相對(duì)分子質(zhì)量低，無(wú)發(fā)色團(tuán)，無(wú)法直接采用液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)藥物及其雜質(zhì)導(dǎo)致樣品基質(zhì)復(fù)雜，因此直接定量肼較為困難。而苯甲醛具有高的反應(yīng)性，可以與活性較低的肼發(fā)生衍生化反應(yīng)，其衍生產(chǎn)物具有較強(qiáng)的紫外吸收，能滿(mǎn)足靈敏度的要求，因此苯甲醛衍生化法較適合測(cè)定肼[10]。

4.2 衍生化時(shí)間的確定

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于不同的企業(yè)輔料不同，結(jié)果部分企業(yè)供試品溶液衍生化15 min時(shí)，溶液渾濁。對(duì)衍生化時(shí)間進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)供試品溶液衍生化1 h，溶液澄清。對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果專(zhuān)屬性、回收率等均良好，因此確定衍生化時(shí)間為1 h。

4.3 原料及制劑中的肼

ICH M7指出肼的每日可接受攝入量為39 μg，硫酸阿米卡星最大日服用劑量為1.5 g，因此肼的限度可定為26 μg/g。本次試驗(yàn)檢測(cè)的參比制劑均未檢出肼，國(guó)內(nèi)企業(yè)硫酸阿米卡星、注射用硫酸阿米卡星、硫酸阿米卡星注射液中的肼分別為未檢出～1.8 μg/g、未檢出～0.2 μg/g、未檢出～3.1 μg/g。表明國(guó)內(nèi)外硫酸阿米卡星及其注射劑中的肼均符合ICH M7的要求；同時(shí)該方法可為其他制劑中的肼的控制提供參考。