胰島素樣生長(zhǎng)因子2在膀胱尿路上皮癌診斷中的價(jià)值

楊庭楷，文 進(jìn)，紀(jì)志剛

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科，北京 100730

尿路上皮癌是最常見的惡性腫瘤之一，可發(fā)生于腎盂、輸尿管、膀胱和尿道，其中以膀胱尿路上皮癌最為常見。膀胱尿路上皮癌常用的診斷方法包括尿液細(xì)胞學(xué)檢查、膀胱鏡檢查，但尿液細(xì)胞學(xué)檢查的靈敏度較低，膀胱鏡檢查為有創(chuàng)性操作，因此，亟需探尋靈敏度、特異度均較高的分子標(biāo)志物用于膀胱尿路上皮癌的診斷。胰島素樣生長(zhǎng)因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)是一種包含67個(gè)氨基酸的肽類激素，在多種惡性腫瘤組織中呈過表達(dá)[1]。外泌體是細(xì)胞主動(dòng)分泌的一類穿梭于細(xì)胞間的細(xì)胞外囊泡，其中富含各種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等物質(zhì)，在細(xì)胞間傳遞信號(hào)等方面發(fā)揮著重要作用[2]。本研究通過熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)尿液外泌體中IGF2表達(dá)水平，探索其在膀胱尿路上皮癌診斷中的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

前瞻性選取2020年9月至12月北京協(xié)和醫(yī)院診治的膀胱尿路上皮癌患者和非尿路上皮癌患者為研究對(duì)象。

膀胱尿路上皮癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)具有完整的病歷資料；(2)經(jīng)膀胱鏡檢查或經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)(transurethral resection of bladder tumor,TURBT)病理確診為膀胱尿路上皮癌；(3)近期未行泌尿生殖系統(tǒng)操作或手術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有其他系統(tǒng)惡性腫瘤史；(2)近期曾行放化療或者免疫抑制劑治療者。

非尿路上皮癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)與膀胱尿路上皮癌患者同期入院；(2)通過CT/MRI等檢查診斷為泌尿系結(jié)石、泌尿系感染、前列腺增生、腎上腺良性腫瘤等疾??；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有其他系統(tǒng)惡性腫瘤史；(2)近期行泌尿生殖系統(tǒng)操作或手術(shù)者。

本研究已通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(審批號(hào)：JS-3178)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本量估算

依據(jù)公式n=Uα2P(1-P)/δ2估算樣本量，其中P分別為估計(jì)的IGF2診斷膀胱尿路上皮癌的靈敏度(用于膀胱尿路上皮癌組樣本量估算，取0.90)和估計(jì)的IGF2診斷膀胱尿路上皮癌的特異度(用于非尿路上皮癌組樣本量估算，取0.80)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，Uα為正態(tài)分布中累積概率為α/2時(shí)的U值(U0.05=1.96)。經(jīng)計(jì)算膀胱尿路上皮癌患者樣本量為35例，非尿路上皮癌患者為61例。

1.2.2 尿液采集和外泌體提取

患者入院后均留取新鮮晨起清潔中段尿。取尿液標(biāo)本(約5 mL)，置于無菌無酶離心管中，采用外泌體提取試劑盒(廣州恒泰生物科技有限公司產(chǎn)品，粵穗械備20202151號(hào))提取尿液中的外泌體，具體操作步驟依據(jù)試劑盒說明書。

1.2.3 核酸提取和反轉(zhuǎn)錄

取外泌體沉淀物，加入Trizol 1 mL，15～30 ℃放置5 min，4 ℃,離心半徑8 cm，2000 r/min 離心10 min保留上清液。加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min，4 ℃,離心半徑8 cm，12 000 r/min離心10 min后樣本分成3層：黃色的有機(jī)相、中間層和無色的水相。將水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加入等體積異丙醇，混勻，15～30 ℃靜置10 min；4 ℃,離心半徑8 cm，12 000 r/min離心5～10 min；去上清液，緩慢沿離心管管壁加入75% 乙醇1 mL，輕輕上下顛倒洗滌離心管；4 ℃,離心半徑8 cm，12 000 r/min離心2 min后棄乙醇；重復(fù)洗滌一次，獲取RNA沉淀，室溫干燥2～5 min，加入適量DEPC水以溶解RNA沉淀，必要時(shí)可用移液器輕輕吹打沉淀，待沉淀完全溶解后立刻進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系：1 pg～1 μg規(guī)格的RNA 6 μL，gDNA去除液2 μL，移液器吹打混勻，42 ℃ 保存2 min；向PCR反應(yīng)管中加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2 μL，移液器吹打混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件：50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 2 min。

1.2.4 PCR檢測(cè)

從試劑盒中取出PCR反應(yīng)液、ROX、引物探針混合物、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，于冰上或4 ℃融化后震蕩混勻,離心半徑8 cm，8000 r/min瞬時(shí)離心后備用。計(jì)算待測(cè)樣本數(shù)(n)，取n+2個(gè)(包含1個(gè)陽性質(zhì)控品和1個(gè)陰性質(zhì)控品)PCR反應(yīng)管，單份擴(kuò)增體系總體積為26 μL，其中15 μL PCR反應(yīng)液1，11 μL PCR反應(yīng)液2。加入4 μL待測(cè)樣本反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，離心半徑8 cm，8000 r/min瞬時(shí)離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。參數(shù)設(shè)置：窗口設(shè)置：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none，Reporter Dye2：CY5，Quencher Dye2：none，Passive Reference：ROX。循環(huán)條件：37 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 8 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，45個(gè)循環(huán)。分別隨機(jī)選取4例膀胱尿路上皮癌患者和4例非尿路上皮癌患者的PCR產(chǎn)物，行瓊脂糖凝膠電泳(圖1)。

圖1 外泌體瓊脂糖凝膠電泳圖A.β-肌動(dòng)蛋白；B.CK20；C.胰島素樣生長(zhǎng)因子2；樣本1～4為膀胱尿路上皮細(xì)胞癌患者，5～8為非尿路上皮癌患者

1.2.5 結(jié)果分析

收集PCR產(chǎn)物，使用配套儀器自動(dòng)調(diào)整基線和閾值，基線Start值為3～15，End值為5～20。在log圖譜中調(diào)整閾值處于擴(kuò)增曲線指數(shù)期，調(diào)整完畢后獲取待測(cè)樣本數(shù)據(jù)。若CY5通道Ct值≤35且FAM通道Ct值≤36，判定IGF2陽性；若CY5通道Ct值≤35且FAM通道Ct值>36，判斷定IGF2陰性；若CY5通道Ct值>35，則樣本的RNA濃度達(dá)不到最低檢測(cè)限要求，需重新檢測(cè)。

1.3 偏倚控制

本研究入選的膀胱尿路上皮癌患者均由膀胱鏡檢查或TURBT病理確診，非尿路上皮癌患者均為非惡性腫瘤疾病，以避免其他類型惡性腫瘤(如腎癌、前列腺癌等)對(duì)研究結(jié)果的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。年齡符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。IGF2陽性表達(dá)率為計(jì)數(shù)資料，以頻數(shù)(百分?jǐn)?shù))表示。以膀胱鏡檢查或TURBT病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算尿液外泌體中IGF2診斷膀胱尿路上皮癌的靈敏度、特異度、陽性似然比與陰性似然比。其中靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性似然比=靈敏度/(1-特異度)；陰性似然比=(1-靈敏度)/特異度。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

共入選符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的膀胱尿路上皮癌患者35例，非尿路上皮癌患者60例(腎上腺疾病患者24例，良性前列腺增生癥患者22例，泌尿系結(jié)石患者14例)。膀胱尿路上皮癌患者中，男性26例，女性9例；平均年齡(65.43±12.22)歲(范圍：45～86歲)。非尿路上皮癌患者中，男性35例，女性25例；平均年齡(61.68±13.07)歲(范圍：12～82歲)，兩組患者年齡、性別比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

2.2 尿液外泌體中IGF2陽性表達(dá)率比較

膀胱尿路上皮癌患者IGF2陽性表達(dá)25例(71.4%)，陰性表達(dá)10例(28.6%)；非尿路上皮癌患者IGF2陽性表達(dá)6例(10.0%)，陰性表達(dá)54例(90.0%)。膀胱尿路上皮癌患者尿液外泌體中IGF2陽性表達(dá)率顯著高于非尿路上皮癌患者(P=0.000)。

2.3 尿液外泌體中IGF2診斷膀胱尿路上皮癌的性能

尿液外泌體中IGF2診斷膀胱尿路上皮癌的靈敏度為71.43%(95% CI：53.48%～84.76%)，特異度為90.00%(95% CI：78.83%～95.87%)，陽性似然比為7.14(95% CI：3.25～15.70)，陰性似然比為0.32(95% CI：0.19～0.54)。

3 討論

本研究對(duì)尿液外泌體中IGF2與膀胱尿路上皮癌的相關(guān)性進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明IGF2在膀胱尿路上皮癌中呈明顯高表達(dá)(陽性率：71.4%)，其診斷膀胱尿路上皮癌的靈敏度為71.43%(95% CI：53.48%～84.76%)，特異度為90.00%(95% CI：78.83%～95.87%)。

全球每年約550 000例新發(fā)尿路上皮癌病例[3]，其中膀胱尿路上皮癌占比90%以上。80%的膀胱尿路上皮癌確診時(shí)為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)，TURBT術(shù)切除后復(fù)發(fā)率高達(dá)50%，其中30%進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer,MIBC)[4]。因此，早期診斷對(duì)改善膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后至關(guān)重要。雖然常規(guī)尿液細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)膀胱尿路上皮癌具有較高的診斷特異度(88.1%)，但總體靈敏度極低(32%)，其中對(duì)高級(jí)別膀胱尿路上皮癌的診斷靈敏度為50.6%，對(duì)低級(jí)別膀胱尿路上皮癌的診斷靈敏度僅為10.3%[5]。

有研究分析了NMP22、CD44、CK20、CEACAM1和BTA 5種尿液腫瘤標(biāo)志物診斷膀胱尿路上皮癌的臨床價(jià)值，結(jié)果表明NMP22的靈敏度最高(85.1%)，但特異度僅為54.7%；雖然CD44的靈敏度(83.2%)和特異度(84.4%)均可[6]，但尚需臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。本次研究旨在探索一種新的無創(chuàng)標(biāo)志物作為膀胱尿路上皮癌篩查、診斷和隨訪的替代方案。

外泌體是由不同類型細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞)主動(dòng)分泌直徑為50～150 nm的雙分子層結(jié)構(gòu)囊泡樣小體[7]，在細(xì)胞間發(fā)揮通訊作用，特別是在腫瘤發(fā)展過程中的作用，已得到臨床認(rèn)可。外泌體相關(guān)的RNA、微RNA、蛋白質(zhì)、DNA，甚至代謝物均可通過自分泌和旁分泌方式作用于受體細(xì)胞。在血液、尿液、唾液和腦脊液等體液中均可檢測(cè)到外泌體，是腫瘤輔助診斷理想的非侵襲性或侵襲性生物標(biāo)志物[8]。

人類IGF2基因定位于染色體11p15，包括9個(gè)外顯子和4個(gè)啟動(dòng)子，是一種有效的促分裂原和凋亡抑制劑，可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展、血管生成，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活至關(guān)重要。IGF2在包括乳腺癌[9]、卵巢癌[10]、結(jié)直腸癌[11]和前列腺癌[12]等在內(nèi)的不同惡性腫瘤組織均呈過表達(dá)。早期研究表明，膀胱尿路上皮癌患者尿液中IGF2水平明顯升高，證實(shí)IGF2是膀胱尿路上皮癌診斷的一種有前景的標(biāo)志物[13]。一項(xiàng)前瞻性多中心隊(duì)列研究對(duì)4種尿液分子標(biāo)志物診斷膀胱膀胱癌的性能進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果顯示IGF2是診斷膀胱尿路上皮癌的核心基因之一[14]。但目前尚缺乏其單獨(dú)作為標(biāo)志物診斷膀胱尿路上皮癌臨床價(jià)值的相關(guān)研究。

本研究初步探索了尿液外泌體中IGF2診斷膀胱尿路上皮癌的臨床效能，結(jié)果表明相較于非尿路上皮癌患者，膀胱尿路上皮癌患者尿液外泌體中IGF2陽性表達(dá)率顯著升高(71.4%比10.0%)，IGF2診斷膀胱尿路上皮癌的靈敏度為71.43%，特異度為90.00%，相比傳統(tǒng)尿液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，其靈敏度和特異度均有不同程度的提高[5]；與腫瘤標(biāo)志物CD44比較，特異度更高，但靈敏度稍低[6]。

本研究局限性：對(duì)照人群僅為非尿路上皮癌患者。后期可增加病例收集范圍，比較膀胱尿路上皮癌與泌尿系統(tǒng)其他惡性腫瘤患者尿液外泌體中IGF2表達(dá)差異，以進(jìn)一步分析IGF2在膀胱尿路上皮癌鑒別診斷中的作用。

綜上，膀胱尿路上皮癌患者尿液外泌體中IGF2呈高表達(dá)，其對(duì)膀胱尿路上皮癌具有較高的診斷特異度，但靈敏度稍低。由于尿液樣本收集簡(jiǎn)便、易行，尿液外泌體中IGF2有望作為分子標(biāo)志物輔助膀胱尿路上皮癌的診斷。

作者貢獻(xiàn)：楊庭楷負(fù)責(zé)標(biāo)本收集、實(shí)驗(yàn)室檢查、數(shù)據(jù)分析、文獻(xiàn)調(diào)研、文章撰寫；紀(jì)志剛負(fù)責(zé)提供實(shí)驗(yàn)思路與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；文進(jìn)負(fù)責(zé)提供實(shí)驗(yàn)思路、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及論文審校。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突