胰島素樣生長因子2在膀胱尿路上皮癌診斷中的價值

楊庭楷，文 進，紀志剛

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科，北京 100730

尿路上皮癌是最常見的惡性腫瘤之一，可發(fā)生于腎盂、輸尿管、膀胱和尿道，其中以膀胱尿路上皮癌最為常見。膀胱尿路上皮癌常用的診斷方法包括尿液細胞學檢查、膀胱鏡檢查，但尿液細胞學檢查的靈敏度較低，膀胱鏡檢查為有創(chuàng)性操作，因此，亟需探尋靈敏度、特異度均較高的分子標志物用于膀胱尿路上皮癌的診斷。胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)是一種包含67個氨基酸的肽類激素，在多種惡性腫瘤組織中呈過表達[1]。外泌體是細胞主動分泌的一類穿梭于細胞間的細胞外囊泡，其中富含各種蛋白質、脂質、核酸等物質，在細胞間傳遞信號等方面發(fā)揮著重要作用[2]。本研究通過熒光定量反轉錄PCR法檢測尿液外泌體中IGF2表達水平，探索其在膀胱尿路上皮癌診斷中的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

前瞻性選取2020年9月至12月北京協(xié)和醫(yī)院診治的膀胱尿路上皮癌患者和非尿路上皮癌患者為研究對象。

膀胱尿路上皮癌患者納入標準：(1)具有完整的病歷資料；(2)經膀胱鏡檢查或經尿道膀胱腫瘤電切術(transurethral resection of bladder tumor,TURBT)病理確診為膀胱尿路上皮癌；(3)近期未行泌尿生殖系統(tǒng)操作或手術。排除標準：(1)有其他系統(tǒng)惡性腫瘤史；(2)近期曾行放化療或者免疫抑制劑治療者。

非尿路上皮癌患者納入標準：(1)與膀胱尿路上皮癌患者同期入院；(2)通過CT/MRI等檢查診斷為泌尿系結石、泌尿系感染、前列腺增生、腎上腺良性腫瘤等疾病；(3)臨床資料完整。排除標準：(1)有其他系統(tǒng)惡性腫瘤史；(2)近期行泌尿生殖系統(tǒng)操作或手術者。

本研究已通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會審批(審批號：JS-3178)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本量估算

依據公式n=Uα2P(1-P)/δ2估算樣本量，其中P分別為估計的IGF2診斷膀胱尿路上皮癌的靈敏度(用于膀胱尿路上皮癌組樣本量估算，取0.90)和估計的IGF2診斷膀胱尿路上皮癌的特異度(用于非尿路上皮癌組樣本量估算，取0.80)；檢驗水準α=0.05，Uα為正態(tài)分布中累積概率為α/2時的U值(U0.05=1.96)。經計算膀胱尿路上皮癌患者樣本量為35例，非尿路上皮癌患者為61例。

1.2.2 尿液采集和外泌體提取

患者入院后均留取新鮮晨起清潔中段尿。取尿液標本(約5 mL)，置于無菌無酶離心管中，采用外泌體提取試劑盒(廣州恒泰生物科技有限公司產品，粵穗械備20202151號)提取尿液中的外泌體，具體操作步驟依據試劑盒說明書。

1.2.3 核酸提取和反轉錄

取外泌體沉淀物，加入Trizol 1 mL，15～30 ℃放置5 min，4 ℃,離心半徑8 cm，2000 r/min 離心10 min保留上清液。加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min，4 ℃,離心半徑8 cm，12 000 r/min離心10 min后樣本分成3層：黃色的有機相、中間層和無色的水相。將水相轉移至新離心管，加入等體積異丙醇，混勻，15～30 ℃靜置10 min；4 ℃,離心半徑8 cm，12 000 r/min離心5～10 min；去上清液，緩慢沿離心管管壁加入75% 乙醇1 mL，輕輕上下顛倒洗滌離心管；4 ℃,離心半徑8 cm，12 000 r/min離心2 min后棄乙醇；重復洗滌一次，獲取RNA沉淀，室溫干燥2～5 min，加入適量DEPC水以溶解RNA沉淀，必要時可用移液器輕輕吹打沉淀，待沉淀完全溶解后立刻進行反轉錄。反轉錄體系：1 pg～1 μg規(guī)格的RNA 6 μL，gDNA去除液2 μL，移液器吹打混勻，42 ℃ 保存2 min；向PCR反應管中加入反轉錄反應液2 μL，移液器吹打混勻后進行反轉錄，反轉錄條件：50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 2 min。

1.2.4 PCR檢測

從試劑盒中取出PCR反應液、ROX、引物探針混合物、陽性質控品、陰性質控品，于冰上或4 ℃融化后震蕩混勻,離心半徑8 cm，8000 r/min瞬時離心后備用。計算待測樣本數(n)，取n+2個(包含1個陽性質控品和1個陰性質控品)PCR反應管，單份擴增體系總體積為26 μL，其中15 μL PCR反應液1，11 μL PCR反應液2。加入4 μL待測樣本反轉錄產物，離心半徑8 cm，8000 r/min瞬時離心后進行PCR擴增。參數設置：窗口設置：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none，Reporter Dye2：CY5，Quencher Dye2：none，Passive Reference：ROX。循環(huán)條件：37 ℃ 2 min，1個循環(huán)；95 ℃ 8 min，1個循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，45個循環(huán)。分別隨機選取4例膀胱尿路上皮癌患者和4例非尿路上皮癌患者的PCR產物，行瓊脂糖凝膠電泳(圖1)。

圖1 外泌體瓊脂糖凝膠電泳圖A.β-肌動蛋白；B.CK20；C.胰島素樣生長因子2；樣本1～4為膀胱尿路上皮細胞癌患者，5～8為非尿路上皮癌患者

1.2.5 結果分析

收集PCR產物，使用配套儀器自動調整基線和閾值，基線Start值為3～15，End值為5～20。在log圖譜中調整閾值處于擴增曲線指數期，調整完畢后獲取待測樣本數據。若CY5通道Ct值≤35且FAM通道Ct值≤36，判定IGF2陽性；若CY5通道Ct值≤35且FAM通道Ct值>36，判斷定IGF2陰性；若CY5通道Ct值>35，則樣本的RNA濃度達不到最低檢測限要求，需重新檢測。

1.3 偏倚控制

本研究入選的膀胱尿路上皮癌患者均由膀胱鏡檢查或TURBT病理確診，非尿路上皮癌患者均為非惡性腫瘤疾病，以避免其他類型惡性腫瘤(如腎癌、前列腺癌等)對研究結果的影響。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。年齡符合正態(tài)分布，以均數±標準差表示。IGF2陽性表達率為計數資料，以頻數(百分數)表示。以膀胱鏡檢查或TURBT病理結果為金標準，計算尿液外泌體中IGF2診斷膀胱尿路上皮癌的靈敏度、特異度、陽性似然比與陰性似然比。其中靈敏度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性似然比=靈敏度/(1-特異度)；陰性似然比=(1-靈敏度)/特異度。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料

共入選符合納入和排除標準的膀胱尿路上皮癌患者35例，非尿路上皮癌患者60例(腎上腺疾病患者24例，良性前列腺增生癥患者22例，泌尿系結石患者14例)。膀胱尿路上皮癌患者中，男性26例，女性9例；平均年齡(65.43±12.22)歲(范圍：45～86歲)。非尿路上皮癌患者中，男性35例，女性25例；平均年齡(61.68±13.07)歲(范圍：12～82歲)，兩組患者年齡、性別比例無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。

2.2 尿液外泌體中IGF2陽性表達率比較

膀胱尿路上皮癌患者IGF2陽性表達25例(71.4%)，陰性表達10例(28.6%)；非尿路上皮癌患者IGF2陽性表達6例(10.0%)，陰性表達54例(90.0%)。膀胱尿路上皮癌患者尿液外泌體中IGF2陽性表達率顯著高于非尿路上皮癌患者(P=0.000)。

2.3 尿液外泌體中IGF2診斷膀胱尿路上皮癌的性能

尿液外泌體中IGF2診斷膀胱尿路上皮癌的靈敏度為71.43%(95% CI：53.48%～84.76%)，特異度為90.00%(95% CI：78.83%～95.87%)，陽性似然比為7.14(95% CI：3.25～15.70)，陰性似然比為0.32(95% CI：0.19～0.54)。

3 討論

本研究對尿液外泌體中IGF2與膀胱尿路上皮癌的相關性進行了初步分析，結果表明IGF2在膀胱尿路上皮癌中呈明顯高表達(陽性率：71.4%)，其診斷膀胱尿路上皮癌的靈敏度為71.43%(95% CI：53.48%～84.76%)，特異度為90.00%(95% CI：78.83%～95.87%)。

全球每年約550 000例新發(fā)尿路上皮癌病例[3]，其中膀胱尿路上皮癌占比90%以上。80%的膀胱尿路上皮癌確診時為非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)，TURBT術切除后復發(fā)率高達50%，其中30%進展為肌層浸潤性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer,MIBC)[4]。因此，早期診斷對改善膀胱尿路上皮癌患者預后至關重要。雖然常規(guī)尿液細胞學檢查對膀胱尿路上皮癌具有較高的診斷特異度(88.1%)，但總體靈敏度極低(32%)，其中對高級別膀胱尿路上皮癌的診斷靈敏度為50.6%，對低級別膀胱尿路上皮癌的診斷靈敏度僅為10.3%[5]。

有研究分析了NMP22、CD44、CK20、CEACAM1和BTA 5種尿液腫瘤標志物診斷膀胱尿路上皮癌的臨床價值，結果表明NMP22的靈敏度最高(85.1%)，但特異度僅為54.7%；雖然CD44的靈敏度(83.2%)和特異度(84.4%)均可[6]，但尚需臨床進一步驗證。本次研究旨在探索一種新的無創(chuàng)標志物作為膀胱尿路上皮癌篩查、診斷和隨訪的替代方案。

外泌體是由不同類型細胞(包括腫瘤細胞)主動分泌直徑為50～150 nm的雙分子層結構囊泡樣小體[7]，在細胞間發(fā)揮通訊作用，特別是在腫瘤發(fā)展過程中的作用，已得到臨床認可。外泌體相關的RNA、微RNA、蛋白質、DNA，甚至代謝物均可通過自分泌和旁分泌方式作用于受體細胞。在血液、尿液、唾液和腦脊液等體液中均可檢測到外泌體，是腫瘤輔助診斷理想的非侵襲性或侵襲性生物標志物[8]。

人類IGF2基因定位于染色體11p15，包括9個外顯子和4個啟動子，是一種有效的促分裂原和凋亡抑制劑，可抑制細胞凋亡，促進細胞周期進展、血管生成，對細胞生長和存活至關重要。IGF2在包括乳腺癌[9]、卵巢癌[10]、結直腸癌[11]和前列腺癌[12]等在內的不同惡性腫瘤組織均呈過表達。早期研究表明，膀胱尿路上皮癌患者尿液中IGF2水平明顯升高，證實IGF2是膀胱尿路上皮癌診斷的一種有前景的標志物[13]。一項前瞻性多中心隊列研究對4種尿液分子標志物診斷膀胱膀胱癌的性能進行了測試，結果顯示IGF2是診斷膀胱尿路上皮癌的核心基因之一[14]。但目前尚缺乏其單獨作為標志物診斷膀胱尿路上皮癌臨床價值的相關研究。

本研究初步探索了尿液外泌體中IGF2診斷膀胱尿路上皮癌的臨床效能，結果表明相較于非尿路上皮癌患者，膀胱尿路上皮癌患者尿液外泌體中IGF2陽性表達率顯著升高(71.4%比10.0%)，IGF2診斷膀胱尿路上皮癌的靈敏度為71.43%，特異度為90.00%，相比傳統(tǒng)尿液細胞學檢測，其靈敏度和特異度均有不同程度的提高[5]；與腫瘤標志物CD44比較，特異度更高，但靈敏度稍低[6]。

本研究局限性：對照人群僅為非尿路上皮癌患者。后期可增加病例收集范圍，比較膀胱尿路上皮癌與泌尿系統(tǒng)其他惡性腫瘤患者尿液外泌體中IGF2表達差異，以進一步分析IGF2在膀胱尿路上皮癌鑒別診斷中的作用。

綜上，膀胱尿路上皮癌患者尿液外泌體中IGF2呈高表達，其對膀胱尿路上皮癌具有較高的診斷特異度，但靈敏度稍低。由于尿液樣本收集簡便、易行，尿液外泌體中IGF2有望作為分子標志物輔助膀胱尿路上皮癌的診斷。

作者貢獻：楊庭楷負責標本收集、實驗室檢查、數據分析、文獻調研、文章撰寫；紀志剛負責提供實驗思路與實驗設計；文進負責提供實驗思路、實驗設計以及論文審校。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突