缺氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中微RNA表達(dá)譜及細(xì)胞凋亡變化

王含必，竇帥杰，劉思邈，張婉玉，劉美芝，鄧成艷

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院 1婦科內(nèi)分泌與生殖中心 國(guó)家婦產(chǎn)疾病臨床研究中心 2疑難重癥及罕見病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730 3北京致成生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，北京 100176

成功妊娠需具備兩個(gè)必備條件：優(yōu)質(zhì)的胚胎和正常的子宮內(nèi)膜容受性，即除對(duì)胚胎質(zhì)量有嚴(yán)格要求外，在允許胚胎植入的窗口期內(nèi)，還需子宮內(nèi)膜保持良好的容受性[1-2]。子宮內(nèi)膜修復(fù)障礙導(dǎo)致的薄型子宮內(nèi)膜(排卵前子宮內(nèi)膜厚度<7 mm)可降低子宮內(nèi)膜的容受性，進(jìn)而影響妊娠[3-4]。薄型子宮內(nèi)膜的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前研究認(rèn)為子宮血供不足可能是影響子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)的重要因素之一[5]，各種原因引起的子宮血流量降低將導(dǎo)致子宮內(nèi)膜處于缺氧環(huán)境，誘發(fā)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞(endometrial glandular epithelial cell,EEC)能量代謝障礙乃至缺氧損傷，最終影響子宮內(nèi)膜的容受性。

子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控涉及子宮內(nèi)膜一系列復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化，適宜水平的EEC凋亡對(duì)于子宮內(nèi)膜容受性的建立至關(guān)重要，凋亡異常將不利于子宮內(nèi)膜保持良好的容受性[6]。p53是調(diào)節(jié)細(xì)胞DNA修復(fù)的重要蛋白，在缺氧、輻射、毒物等導(dǎo)致的基因損傷無法修復(fù)時(shí)，p53則進(jìn)入線粒體并活化促凋亡基因，促進(jìn)凋亡小體復(fù)合物形成，啟動(dòng)凋亡。微RNA(micro-RNA，miRNA)是一類具有20～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA[7]，其通過與信使RNA互補(bǔ)結(jié)合，可影響靶蛋白表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和血管生成等多方面發(fā)揮調(diào)控效應(yīng)[8]。缺氧環(huán)境可誘導(dǎo)多種細(xì)胞釋放大量miRNA[9]，且缺氧環(huán)境可誘發(fā)細(xì)胞的代謝活動(dòng)進(jìn)行重編程，增強(qiáng)凋亡信號(hào)傳導(dǎo)[10]。目前尚不明確缺氧環(huán)境是否可引起EEC中miRNA表達(dá)譜異常，進(jìn)而影響p53蛋白表達(dá)，促進(jìn)EEC凋亡。本研究探究缺氧環(huán)境對(duì)EEC中miRNA表達(dá)譜的影響及miRNA調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為薄型子宮內(nèi)膜引起子宮內(nèi)膜容受性降低的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

本研究主要試劑包括EEC原代細(xì)胞及配套培養(yǎng)基(武漢普諾賽公司)、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)、0.25% 胰蛋白酶、Trizol RNA提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen 公司)、兔抗p53抗體(一抗，美國(guó)Cell Signaling Technology 公司)；HRP-山羊抗鼠IgG抗體(通用型，二抗)、HRP-山羊抗兔IgG抗體(通用型，二抗)、DAB顯色劑(丹麥DAKO公司)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、反轉(zhuǎn)錄酶試劑(5×Reverse Transcriptase M-MLV)、緩沖液Reverse Transcriptase M-MLV、RNA酶抑制劑(日本TaKaRa公司)、2×Mltra Master Mix、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、不含RNA酶的水和dNTP(中國(guó)康為世紀(jì)有限公司)、引物(上海生工有限公司)。主要設(shè)備包括BX19-HK830倒置相差顯微鏡(深圳市奧斯微光學(xué)儀器有限公司)、Ni-U正置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)、7500 Fast Real-Time PCR System熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)、VeritiProTM梯度PCR儀、Micro17R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)、SC-2546實(shí)驗(yàn)室臺(tái)式低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)以及CLINX ChemiScope6100化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 EEC培養(yǎng)與分組

取EEC原代細(xì)胞培養(yǎng)于配套的專用生長(zhǎng)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含胎牛血清、生長(zhǎng)添加劑、青霉素、鏈霉素，O2∶CO2體積比為95∶5。待EEC密度增長(zhǎng)至80%～90%，采用0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EEC，接種至六孔板并隨機(jī)分為缺氧組和對(duì)照組(每組1×105個(gè)細(xì)胞/孔，每組3個(gè)復(fù)孔)。缺氧組、對(duì)照組分別置于缺氧環(huán)境(O2∶N2∶CO2體積比為1∶94∶5)[11]和正常氧環(huán)境(O2∶CO2體積比為95∶5)中培養(yǎng)，4 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 miRNA表達(dá)譜改變

收集兩組EEC至EP管中(2×106個(gè)細(xì)胞/管)，加入1 mL Trizol提取EEC中的總RNA。采用高通量測(cè)序法進(jìn)行RNA測(cè)序，并繪制miRNA表達(dá)譜聚類熱圖。

1.2.3 miR-7974、miR-7704基因表達(dá)檢測(cè)

將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測(cè)EEC中miR-7974、miR-7704基因表達(dá)水平。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，10 μmol/L規(guī)格的上、下游引物各1 μL(表1)，Master Mix 10 μL和不含RNA酶的水8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)；60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以sno-RNA202為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-7974、miR-7704基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EEC凋亡情況。收集兩組細(xì)胞置于離心機(jī)中，常溫下，離心半徑16 cm，800 r/min離心10 min棄上清液；采用PBS 重懸沉淀，制成單細(xì)胞懸液并分裝至EP 管中。采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒標(biāo)記相應(yīng)抗體(每組各設(shè)1個(gè)空白對(duì)照)，室溫避光孵育25 min后置于離心機(jī)中。常溫下，離心半徑16 cm，3000 r/min 離心5 min；加入1 mL PBS去除多余抗體后加入 200 μL多聚甲醛固定細(xì)胞，置于流式細(xì)胞儀中上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果以流式細(xì)胞圖表示。

1.2.5 miR-7704的靶蛋白p53及凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)

通過檢索TargetScan、miRDB、miRWalk 3個(gè)生物信息學(xué)網(wǎng)站，發(fā)現(xiàn)miR-7974的靶基因可能為p53(圖1A)。本研究通過堿基互補(bǔ)配對(duì)，發(fā)現(xiàn)miR-7974可與p53的3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region,3’UTR)連續(xù)9個(gè)堿基相配對(duì)(圖1B)，因此，推測(cè)p53為miR-7974的靶基因。半胱天冬酶3(caspase3)是細(xì)胞凋亡過程中重要的執(zhí)行者，其直接參與可促進(jìn)凋亡小體形成的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)分解[12]，B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)是重要的抗凋亡蛋白，caspase3水平增加、Bcl-2水平降低將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增多和DNA損傷[13]。

本研究采用蛋白印跡法(Western blot)測(cè)定miR-7704靶蛋白(p53)和凋亡過程中的重要蛋白表達(dá)水平。收集兩組細(xì)胞，4 ℃下加入細(xì)胞裂解液(1∶1000)，靜置30 min后10 000×g離心25 min收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg 蛋白樣品，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白印記至PVDF膜，并采用含5% 脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h；加入兔單抗p53(Abcam ab26)、兔單抗Cleaved-caspase3(caspase3的活化形式，Abcam ab32042)兔單抗Bcl-2一抗(Abcam ab182858)及鼠單抗β-Tubulin，4 ℃孵育過夜，采用TBST緩沖液 洗膜3次；加入山羊抗兔、山羊抗鼠二抗，室溫孵育 1 h，采用 TBST緩沖液洗膜 3 次。采用ChemiScope6100化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 GraphPad Prism 7.00軟件繪制圖表及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。miRNA表達(dá)譜、miR-7704和miR-7974相對(duì)表達(dá)量等計(jì)數(shù)資料的組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧引起miRNA表達(dá)譜變化

采用高通量測(cè)序法對(duì)miR-215-5p、miR-7851-3p、miR-369-5p等21種常見miRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，缺氧組EEC中16種miRNA表達(dá)上調(diào)，5種miRNA表達(dá)下調(diào)(圖2)。其中對(duì)照組表達(dá)豐度較高的miR-7704和miR-7974，在缺氧組表達(dá)下降最為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，提示缺氧環(huán)境可引起EEC中miRNA表達(dá)譜改變。

圖2 缺氧組和對(duì)照組EEC中微RNA表達(dá)譜的聚類熱圖EEC：子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞

2.2 缺氧引起EEC中miR- 7974表達(dá)顯著下調(diào)

RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，缺氧組EEC中miR-7704和miR-7974相對(duì)表達(dá)量分別降低20%、80%(圖3)，提示miR-7974可能受缺氧環(huán)境的影響更大，對(duì)EEC生物學(xué)功能的影響更顯著。

圖3 缺氧組和對(duì)照組EEC中miR-7704和miR-7974相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖EEC：同圖2；與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.001

2.3 缺氧誘導(dǎo)EEC凋亡

對(duì)照組有少量早期凋亡的EEC，幾乎無晚期凋亡細(xì)胞。與對(duì)照組比較，缺氧組早期凋亡率、晚期凋亡率均明顯增高(P均<0.001，圖4)，提示缺氧環(huán)境可誘導(dǎo)EEC發(fā)生明顯的凋亡。

圖4 缺氧組和對(duì)照組EEC凋亡的流式細(xì)胞圖EEC：同圖2

2.4 缺氧環(huán)境誘導(dǎo)miR-7974的靶蛋白p53表達(dá)上升

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，缺氧組EEC中p53蛋白表達(dá)升高，伴抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低(P均<0.05)，Cleaved-caspase3無顯著變化(P>0.05)，提示缺氧誘發(fā)EEC中miR-7974表達(dá)下調(diào)，可能通過上調(diào)其靶蛋白p53水平進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖5)。

圖5 缺氧組和對(duì)照組凝膠電泳圖Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤-2

3 討論

子宮內(nèi)膜良好的容受性與胚胎著床密切相關(guān)，EEC是子宮內(nèi)膜的主要構(gòu)成成分，EEC損傷將直接影響子宮內(nèi)膜的功能狀態(tài)[4]。多種因素可損傷EEC，包括孕期人工流產(chǎn)等妊娠狀態(tài)的宮腔操作、子宮內(nèi)膜病變的反復(fù)刮宮術(shù)、宮腔感染(如結(jié)核桿菌感染)等，損傷的病理機(jī)制與外界因素引起子宮血管損傷，子宮內(nèi)膜缺血、缺氧導(dǎo)致的EEC凋亡增多有關(guān)。本研究從分子水平探索了EEC的損傷機(jī)制，結(jié)果顯示缺氧環(huán)境可引起miRNA表達(dá)譜改變，其中以miR-7974對(duì)缺氧最為敏感。缺氧導(dǎo)致的miR-7974顯著下調(diào)可促進(jìn)其靶蛋白p53表達(dá)，繼而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致EEC損傷。

暴露于缺氧環(huán)境的生物體首先可通過一系列自身調(diào)節(jié)，產(chǎn)生多種適應(yīng)性信號(hào)，以促進(jìn)細(xì)胞存活，但持續(xù)性缺氧可活化基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，改變細(xì)胞的行為和功能，發(fā)生細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致不可逆損傷[14]。缺氧環(huán)境下，EEC可發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過量的腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、環(huán)氧合酶2、前列腺素E2等炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷和凋亡，但促進(jìn)凋亡的具體機(jī)制尚未闡明[15]。miRNA通過調(diào)控靶基因、靶蛋白表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為，是生命活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)因子。其調(diào)控機(jī)制：miRNA以堿基互補(bǔ)的原則與靶基因信使RNA的3’UTR相結(jié)合，進(jìn)而阻斷信使RNA翻譯或使其降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白的調(diào)控。目前已明確，miRNA參與腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病等疾病進(jìn)程的調(diào)控，是臨床研究的熱點(diǎn)。缺氧環(huán)境是否影響EEC中miRNA表達(dá)及其病理機(jī)制尚未明確。

本研究團(tuán)隊(duì)在缺氧條件下對(duì)EEC進(jìn)行培養(yǎng)，以期誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，模仿薄型子宮內(nèi)膜的病理過程。首先通過高通量測(cè)序法對(duì)EEC中miRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示21種常見miRNA中，缺氧環(huán)境下16種表達(dá)上調(diào)，5種表達(dá)下調(diào)，提示缺氧環(huán)境可誘導(dǎo)EEC中miRNA表達(dá)譜發(fā)生改變。進(jìn)一步對(duì)正常氧環(huán)境時(shí)EEC高表達(dá)，缺氧環(huán)境中表達(dá)降低最為顯著的miR-7704和miR-7974進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于對(duì)照組，缺氧組miR-7704和miR-7974相對(duì)表達(dá)量分別降低20%、80%，提示miR-7974對(duì)缺氧更為敏感，可能對(duì)EEC生物學(xué)功能的影響更顯著。

本研究缺氧組EEC早期凋亡率、晚期凋亡率均明顯升高，表明細(xì)胞凋亡增多可能是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜損傷的機(jī)制之一。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，缺氧的EEC中p53表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，進(jìn)一步提示其呈現(xiàn)高凋亡狀態(tài)。p53基因是重要的抑癌基因，通過凋亡途徑促進(jìn)損傷的細(xì)胞死亡，是其修復(fù)DNA損傷、發(fā)揮抑癌功能的重要方面。正常生理情況下，p53 蛋白以低水平無活性形式存在于機(jī)體細(xì)胞中，當(dāng)發(fā)生DNA嚴(yán)重破壞或細(xì)胞暴露于其他不利環(huán)境時(shí)，p53蛋白的半衰期明顯延長(zhǎng)[16]，并進(jìn)入線粒體激活Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 association X protein,Bax)、凋亡蛋白酶激活因子1、Noxa等促凋亡蛋白，抑制Bcl-2家族(Bcl-2、Bcl-X、Beclin-1)等抗凋亡蛋白表達(dá)[12]，上調(diào)凋亡水平。Bcl-2是研究較多的抗凋亡蛋白，通過阻斷線粒體細(xì)胞色素C釋放并與Bax、Bcl-X相互作用抑制細(xì)胞凋亡[17-18]。Bcl-2表達(dá)降低可間接促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放、凋亡酶形成和caspase3活化，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)分解，啟動(dòng)凋亡[19]。因此，推測(cè)缺氧環(huán)境誘導(dǎo)的miR-7974表達(dá)降低可活化p53，引起EEC大量凋亡，引發(fā)EEC損傷，最終導(dǎo)致子宮內(nèi)膜損傷和子宮容受性降低。

本研究局限性：(1)有研究將Bcl-2與Bax的比值作為凋亡的評(píng)價(jià)指標(biāo)，判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡、評(píng)判凋亡的趨勢(shì)[20-21]。本研究?jī)H通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p53可能為miR-7974的靶蛋白，未評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡趨勢(shì)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可考慮將Bcl-2與Bax比值作為細(xì)胞凋亡的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步分析miR-7974對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控能力。(2)缺氧僅為薄型子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)膜形成的因素之一，機(jī)械損傷、頻繁刮宮等破壞子宮內(nèi)膜的血供和營(yíng)養(yǎng)供給，亦在其中發(fā)揮重要作用。本研究?jī)H構(gòu)建缺氧環(huán)境，探究其對(duì)薄型子宮內(nèi)膜的影響，未能全面模擬薄型子宮內(nèi)膜發(fā)生的機(jī)制。(3)此實(shí)驗(yàn)為體外培養(yǎng)，尚缺乏動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上，缺氧環(huán)境可誘導(dǎo)EEC中miRNA表達(dá)譜改變，其中以miR-7974表達(dá)下調(diào)為最顯著。miR-7974水平降低可促進(jìn)其靶蛋白p53表達(dá)，誘發(fā)EEC凋亡。本研究從基因水平揭示了缺氧引起子宮內(nèi)膜損傷的可能機(jī)制，為相關(guān)疾病的治療提供了新的研究線索。

作者貢獻(xiàn)：王含必負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫；竇帥杰負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫；劉思邈、張婉玉、劉美芝負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施；鄧成艷為項(xiàng)目總負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)研究設(shè)計(jì)、論文寫作及修改。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突