雙孢蘑菇復(fù)合生物保鮮劑的制備及其在貯藏保鮮的應(yīng)用

商立超，王文亮，弓志青，崔文甲，賈鳳娟，趙鳳春，王延圣*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與營養(yǎng)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新食品資源加工重點實驗室，山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室，山東濟南 250100）

（2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271000）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又名白色蘑菇、紐扣蘑菇、洋蘑菇，傘菌目，蘑菇科，蘑菇屬，是世界上分布范圍最廣和最受青睞的食用菌之一[1]，可鮮銷、罐藏、鹽漬。隨著科技的不斷發(fā)展，國內(nèi)雙孢蘑菇工廠化生產(chǎn)逐漸成為主流，菇房能夠精確控制溫度、濕度和光線等生長條件[2]，從而實現(xiàn)一年四季不間斷生產(chǎn)。直至目前，我國雙孢蘑菇的產(chǎn)量和產(chǎn)值均居世界第一位，出口量相當(dāng)大，其中種植最多的省份是福建、山東、河南等，年栽培總面積6.8×108m2，產(chǎn)量4.6×105t（約占全國生產(chǎn)總量75%）。雙孢蘑菇味道鮮美，口感極佳，富含維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，具有抗癌、降血壓、提高人體免疫力等多種保健功能[3]以及高蛋白、低脂肪、低熱量的特點[4]，被賦予“植物肉”、“素中之王”的美稱。雙孢蘑菇表面沒有任何保護結(jié)構(gòu)，在采摘過程中極易受到機械損傷，且采后代謝旺盛，均會導(dǎo)致菇體出現(xiàn)褐變、失水、開傘、菌柄過長等問題，不宜貯藏，造成巨大的經(jīng)濟損失。

普遍認(rèn)為，影響雙孢蘑菇保鮮因素有溫度、呼吸強度、相對濕度、氣體環(huán)境和采摘時菇體成熟度等[5]，因此可通過控制以上因素實現(xiàn)貯藏保鮮的目的。目前，雙孢蘑菇的保鮮手段有低溫貯藏、輻射保鮮、氣調(diào)保鮮、涂膜保鮮等[6]，但低溫和輻射保鮮耗能大，單一氣調(diào)保鮮效果差，而化學(xué)保鮮雖在其他果蔬早已應(yīng)用，如柑橘等，但安全系數(shù)低[7,8]。相對而言，生物涂膜保鮮健康、來源廣泛，并且近年來已有研究發(fā)現(xiàn)生物源（包括植物源、動物源和微生物源）保鮮劑對某些果蔬采后貯藏保鮮具有良好效果[9,10]，但問題是單一保鮮劑效果不明顯，因此基于有效保鮮成分之間的協(xié)同作用，將單一保鮮劑復(fù)合為可食用涂膜應(yīng)用于貯藏保鮮，有效保鮮成分之間通過協(xié)同作用能夠顯著提高保鮮效果，儼然已成為如今貯藏保鮮技術(shù)的研究熱點之一[5]。

本文主要以茶多酚、L-精基酸、L-谷基酸、Vc、大蒜提取液、ε-聚賴氨酸、Nisin、生姜提取液、果膠、黃原膠、卡拉膠和水溶性殼聚糖等12 種常見保鮮劑作為試驗材料，通過評比白度、開傘度、質(zhì)地、發(fā)粘度和氣味初步篩選出對雙孢蘑菇保鮮效果較好的單一保鮮劑，隨后將擇優(yōu)篩選出的保鮮劑通過響應(yīng)面進行復(fù)合并優(yōu)化濃度，研究Vc-Nisin-卡拉膠復(fù)合生物保鮮劑對雙孢蘑菇的保鮮效果，為尋找安全高效的雙孢蘑菇貯藏保鮮劑提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雙孢蘑菇、生姜、大蒜，山東省濟南市歷城區(qū)蘇家市場；茶多酚（純度99%）、ε-聚賴氨酸（純度95%）、Vc（食品級，純度99%），上海源葉生物科技有限公司；L-谷氨酸、L-精氨酸、鄰苯二酚（純度均為99%），阿拉丁試劑（上海）有限公司；Nisin（效價1100 IU/mg），浙江新銀象生物工程有限公司；卡拉膠、黃原膠、果膠、水溶性殼聚糖（均為食品級），河南萬邦實業(yè)有限公司；2,2’-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二銨鹽）（ABTS）（純度 98%），上海麥克林生物試劑公司；2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH）（純度98%），北京酷來搏科技有限公司；濃鹽酸、甲醇、乙酸、乙酸鈉（均為分析純），國藥集團化學(xué)試劑公司；LW-S500B 型無孔包裝盒，福建廈門鮮元包裝有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NewClassic ME 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IN612C 型低溫恒溫培養(yǎng)箱，重慶雅馬拓科技有限公司；CR-400 型色差儀，河北美能達(dá)建材科技有限公司；UV-6100 型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；HH-S6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司；SB25-12DTD型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；FSH-2 型可調(diào)高速勻漿機，常州市偉嘉儀器制造有限公司；DTY-ZBJ-40 型制冰機，北京德天佑科技公司；TGL-16A 型離心機，湖南平凡科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 保鮮劑配制與樣品處理

1.3.1.1 保鮮劑配制

通過查閱和研讀有關(guān)貯藏保鮮方面的資料，確定了待篩選的保鮮劑類別和濃度，分別為茶多酚（5.00 g/L）、L-谷氨酸（10.00 mmol/L）、L-精氨酸（10.00 mmol/L）、Vc（0.50 g/L）、大蒜提取液（料液比1:5 g/mL）、ε-聚賴氨酸（0.30 g/L）、Nisin（0.40 g/L）、生姜提取液（料液比1:3 g/mL）、果膠（5.00 g/L）、黃原膠（2.00 g/L）、卡拉膠（3.00 g/L）、水溶性殼聚糖（10.00 g/L）。

茶多酚、L-谷氨酸、L-精氨酸、Vc、ε-聚賴氨酸、Nisin 和水溶性殼聚糖保鮮劑的制備：根據(jù)濃度，將適量固體試劑與適量無菌蒸餾水混勻溶解即可，低溫保存?zhèn)溆谩｜S原膠保鮮劑的制備：1.00 g 黃原膠粉與500 mL 70 ℃無菌蒸餾水混合，浸泡10 h后攪拌均勻即可。果膠保鮮劑的制備：2.50 g 果膠粉與500 mL 90～95 ℃無菌蒸餾水混合，高速剪切至無結(jié)塊，然后在95 ℃下保溫15 min 至溶膠充分即可。卡拉膠保鮮劑的制備：1.50 g 卡拉膠粉與500 mL 室溫?zé)o菌蒸餾水混勻，浸泡5 h 后水浴加熱，從室溫逐漸加熱至75 ℃，期間不停攪拌至均勻即可。大蒜提取液、生姜提取液的制備：分別取無病蟲害、無機械損傷的大蒜、生姜各100 g，按料液比加入無菌蒸餾水（大蒜500 mL、生姜300 mL），研磨成勻漿，然后將大蒜勻漿和生姜勻漿分別在35 ℃和45 ℃水浴條件下各不斷攪拌30 min，最后12000 r/min 離心10 min 取上清即可，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 樣品處理

試驗前，挑選大小一致、無機械損傷和病蟲害的新鮮雙孢蘑菇，并于4 ℃冷庫中預(yù)冷6 h，預(yù)冷結(jié)束后使用無菌刀片切除多余菌柄使其能平穩(wěn)放置，并將其分組編號；試驗時，用單一保鮮劑浸泡30 s，待水分完全蒸發(fā)后裝入PET 無孔保鮮盒中，一并置于4 ℃低溫恒溫培養(yǎng)箱中貯藏。以無菌蒸餾水浸泡30 s 為陰性對照（CK）。

1.3.2 擇優(yōu)篩選試驗

通過預(yù)試驗可知，不同處理組之間的差異在貯藏第8 d 最顯著，選擇貯藏第8 d 的雙孢蘑菇為試驗樣品，通過白度值和感官評價高低對保鮮效果進行評價，擇優(yōu)篩選得到的保鮮劑進行下一步響應(yīng)面復(fù)合優(yōu)化試驗。

白度值測定：使用便攜式色差計測定雙孢蘑菇傘蓋固定3 個位點（正三角形頂點）并記錄，隨附的標(biāo)準(zhǔn)白板用于校準(zhǔn)色差。每個處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)50 個子實體。

感官評價：參考于官楚[11]的感官評價方法并稍作修改，制定了感官指標(biāo)評價標(biāo)準(zhǔn)表，如表1 所示。由按國家標(biāo)準(zhǔn)招募和培訓(xùn)后的十名優(yōu)選評價員（男女各5 名）[12]按照國家標(biāo)準(zhǔn)[13]對試驗樣品進行感官評定并打分。每個處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)50 個子實體。

表1 雙孢蘑菇感官指標(biāo)評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation criteria for sensory indexes of Agaricus bisporus

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

1.3.3.1 單因素考察試驗

通過預(yù)試驗得知不同濃度處理組之間差異在貯藏第8 d 最顯著，因此，選擇貯藏第8 d 的雙孢蘑菇作為評價對象分析Vc、Nisin 和卡拉膠及其水平對子實體白度值和感官評價的影響，單因素試驗因素水平設(shè)計見表2。每組試驗隨機選取50 個蘑菇進行測定，重復(fù)三次。

表2 單因素試驗因素水平設(shè)計表Table 2 Factor level design table of single factor test

1.3.3.2 響應(yīng)面試驗

以Vc（A）、Nisin（B）和卡拉膠（C）為響應(yīng)因素，以白度值為響應(yīng)值（Y），設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗。響應(yīng)面試驗因素水平見表3。

表3 響應(yīng)面試驗因素水平Table 3 Factors and levels in response surface design

1.3.3.3 響應(yīng)面預(yù)測及驗證試驗

以同一品種雙孢蘑菇作為試驗對象，在與響應(yīng)面試驗相同的試驗條件下，依據(jù)響應(yīng)面預(yù)測結(jié)果即最佳濃度設(shè)置試驗進行驗證，觀察貯藏0～8 d 雙孢蘑菇白度值的變化情況。以白度值為縱坐標(biāo)，以貯藏天數(shù)為橫坐標(biāo)作圖。

白度值測定方法同1.3.2，設(shè)置3 組平行，每組處理50 個雙孢蘑菇。

1.3.4 貯藏品質(zhì)測定試驗

1.3.4.1 子實體表觀指標(biāo)的測定

失重率測定：采用稱重法。重復(fù)三次，每次處理固定25 個子實體。其計算方式如下：

硬度測定：利用TA.XT.plus 型質(zhì)構(gòu)儀對雙孢蘑菇菌蓋表面進行測定，選用直徑2.00 mm 的圓柱形平端探頭（P/2），把雙孢蘑菇去掉菇柄使其穩(wěn)固在質(zhì)構(gòu)儀操作臺上，測試點為菌蓋中心點，選擇壓縮測試模式，測前速度1.00 mm/s、測中和測后速度2.00 mm/s，下壓深度為6.00 mm，接觸出發(fā)力為5.00 g，力-時間關(guān)系曲線圖像自動生成，以圖像最高峰為硬度指標(biāo)，每次測定隨機選取50 朵蘑菇并取其平均值。

腐爛率測定：定義雙孢蘑菇腐爛面積高于50%即為腐爛。其計算方式如下：

每次測定隨機選取50 朵蘑菇，重復(fù)三次。

1.3.4.2 子實體生理指標(biāo)的測定

取樣：用直徑1.00 cm 打孔器在子實體傘蓋赤道位置選擇等距離三個點，取皮下深度為5.00 mm果肉組織，隨后立即用大小均一的錫箔紙包裝并液氮冷凍處理，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。以無菌蒸餾水浸泡為陰性對照（CK 組），以不作任何處理為空白對照（BC 組），每次處理50 個子實體。

總酚含量測定：參照范存斐等[14]的方法。

PPO 活性測定：參照YU Kaibo 等[15]的方法。

DPPH 自由基清除率：參照QIAO Jingya 等[16]的方法。

ABTS 陽離子自由基清除率：參照賈仕杰等[17]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

各項指標(biāo)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，使用IBM SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，運用Duncan 多重比較法對差異顯著性進行比較分析（p＜0.05），使用Microsoft Excel 2019 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一保鮮劑擇優(yōu)篩選結(jié)果

抗氧化型、抑菌型和成膜型保鮮劑對雙孢蘑菇白度值和感官評價的影響見圖1。茶多酚處理組白度值和感官評價分值顯著下降（p＜0.05），分別為73.77 和17.47 分，低于CK 6.01%和16.89%，表明茶多酚自身顏色會嚴(yán)重降低菇體商品價值；L-谷氨酸和L-精氨酸都屬于非必需氨基酸[18,19]，在水果保鮮有所應(yīng)用[20]，本研究中L-精氨酸在一定程度上可延緩雙孢蘑菇褐變，但效果并不突出，白度僅為80.18，而L-谷氨酸處理組白度值78.36 和感官評分22.18，與對照組并無明顯差別，表明無保鮮效果；Vc 可清除機體內(nèi)H2O2和·O2-，保護細(xì)胞膜，其作為一種天然保鮮劑，在切花、果實、種子和塊根上的保鮮作用己得到證實[21,22]，而通過本研究發(fā)現(xiàn)，Vc 處理組的白度值在所有組別中下降幅度最小，貯藏末期為82.13，較貯藏前僅降低9.67%，同時開傘和發(fā)黏程度明顯降低，質(zhì)地和氣味保持良好，感官評價高達(dá)29.51 分，并達(dá)到顯著水平（p＜0.05），表明Vc 能夠有效延緩雙孢蘑菇褐變，延緩衰老。綜合考慮，選擇Vc 作為抗氧化型保鮮材料進行下一步試驗。

大蒜、生姜屬于香辛料，張強等[23]將其應(yīng)用到冷卻肉保鮮上并證明保鮮效果良好，但本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜、生姜提取液白度值分別為73.46、75.51，感官評價14.25、17.19 分，對雙孢蘑菇不僅無保鮮效果，反而降低了品質(zhì)，這兩組處理的白度值分別低于CK 組6.76%和4.16%并顯著（p＜0.05）；ε-聚賴氨酸是由25～30 個賴氨酸殘基構(gòu)成，在人體內(nèi)降解為必需氨基酸[24]，對冷鮮豬肉有較好保鮮效果[25]，但對雙孢蘑菇保鮮效果一般，白度值81.45，僅高出CK 組3.37%；Nisin 是由34 個氨基酸組成的多肽類化合物，穩(wěn)定性好、食用安全，被廣泛應(yīng)用于果蔬、乳制品、肉制品等食品貯藏保鮮中[26]，Nisin 處理組白度值和感官評價最高，分別為83.42和26.14 分，高于CK 組5.89%和40.00%，說明Nisin能夠通過有效抑制微生物活動，減少其對菇體表面的侵害，保持子實體細(xì)胞完整性，從而延緩雙孢蘑菇腐爛變質(zhì)及褐變的產(chǎn)生，維持雙孢蘑菇白度值和感官品質(zhì)，保證其商品價值。綜合考慮，選擇Nisin作為抑菌型保鮮材料進行下一步試驗。

多糖類涂膜保鮮是利用其粘附性使得果蔬樣品表面帶有一層薄膜，從而抑制呼吸作用、保持酚類、類黃酮、抗壞血酸等物質(zhì)較高含量水平，以及提高抗氧化酶活力[27]，最終延緩果蔬新鮮度下降，延長貨架期。已有研究表明，多糖涂膜能夠有效保持果實色澤和硬度，延緩營養(yǎng)流失，降低腐爛率，比如櫻桃[28]、番茄[29]等。由圖1 可知，較CK 組（白度值78.79；感官評價20.42 分）而言，果膠處理組感官評價22.57 分，雖略有提高，但白度值（77.12）卻不增反降，表明果膠可能促進褐變的發(fā)生；黃原膠和水溶性殼聚糖處理組在感官評價（24.12 分和26.45 分）和白度值兩方面都有所提高，但在延緩褐變方面，兩組處理白度值分別為79.71 和78.68，較CK 組均不顯著，無明顯差別；而卡拉膠處理組在貯藏第8 d 的白度值依然高達(dá)82.96 并顯著（p＜0.05），感官評價28.87 分，分別是CK 組的1.05倍和1.41 倍。因此，綜合考慮，選擇卡拉膠作為成膜型保鮮材料進行下一步試驗。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 Vc 濃度選擇

不同濃度Vc 對雙孢蘑菇白度值和感官評價的影響見圖2。隨著Vc 濃度逐漸增大，白度值和感官評價均先緩慢升高后逐漸減小。由圖2a 可知，白度值分別為79.35、82.96、83.89、82.57 和74.81。相對于CK 組77.37，0.20～1.10 g/L Vc 均可提高白度值，分別提高2.56%、7.23%、8.43%、6.72%，0.50、0.80、1.10 g/L 達(dá)到顯著水平（p＜0.05）；由圖2b 可知，感官評價23.70、29.20、33.90、33.30和24.00 分。Vc 在0.20～1.10 g/L 濃度范圍內(nèi)可抑制開傘、發(fā)黏以及異味的產(chǎn)生。產(chǎn)生此結(jié)果的原因為Vc 是能將醌類物質(zhì)還原成酚類物質(zhì)的還原劑，還是PPO 分子結(jié)構(gòu)中銅離子的螯合劑，能夠降低或抑制PPO 活性，兩方面協(xié)同保持新鮮度[30]。但是過多Vc 則會因被氧化分解而積累較多的脫氫抗壞血酸（DHAA），DHAA 又會與氨基酸反應(yīng)促進褐變的發(fā)生[31]，本試驗結(jié)果也證明了這一點，1.40 g/L Vc處理組白度值低于CK 組4.94%。因此考慮選擇0.50、0.80、1.10 g/L 作為響應(yīng)面因素考察水平。

2.2.2 Nisin 濃度選擇

不同濃度Nisin 對雙孢蘑菇白度值和感官評價的影響見圖3。隨著Nisin 濃度不斷增加，白度值和感官評價菌呈現(xiàn)先增大后降低趨勢。由圖3a 和圖3b 可知，0.10、0.25、0.40、0.55 g/L 處理組白度值分別為78.84、81.88、84.23 和82.17，高于CK 組1.90%、5.83%、8.87%、6.20%，其中0.25～0.55 g/L均顯著高于CK 組，并且感官評價分別為20.30、25.90、33.70 和29.00 分，這表明Nisin 可降低雙孢蘑菇褐變、開傘和發(fā)黏程度、延緩變軟進程、抑制異味產(chǎn)生，這是因為Nisin 能改變細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓、破壞細(xì)胞膜完整性、影響磷脂化合物合成，進而減少微生物的侵害，延長貨架期。0.55 和0.70 g/L 處理組雖在控制開傘、保持質(zhì)地和抑制發(fā)黏方面較出色，但因Nisin 本身為淡黃色，顏色會隨濃度增大而加深，當(dāng)雙孢蘑菇白度值分別低于80.00和69.00 時，從批發(fā)和消費者角度出發(fā)，是不被接受的[32,33]。最終Nisin 濃度選擇0.25、0.40、0.55 g/L作為響應(yīng)面因素考察水平。

2.2.3 卡拉膠濃度選擇

不同濃度卡拉膠對雙孢蘑菇白度值和感官評價的影響見圖4。由圖4a 可知，所有濃度卡拉膠均能抑制雙孢蘑菇白度值下降，分別為82.86、83.78、84.85、83.75 以及83.96；由圖4b 可知，感官評價分別為26.20、28.60、34.70、27.90 和20.80 分，依然滿足消費者需求[33]。這是由于卡拉膠作為多糖類可食性涂膜成分之一，能夠附著在雙孢蘑菇表面進而阻滯水分、氧氣和溶質(zhì)的流動，降低生理代謝水平，提高感官屬性和新鮮度[34]。與CK 組相比較，1.00～9.00 g/L 卡拉膠處理組均可保持較高的白度值并顯著（p＜0.05），但隨著濃度增加白度值并沒有得到提高，反而會影響感官品質(zhì)。感官評價中，5.00 g/L處理組效果最好；而7.00 和9.00 g/L 處理組雖在一定程度上保持質(zhì)地和控制開傘，但濃度過大會導(dǎo)致異味產(chǎn)生以及黏度增加，這是導(dǎo)致它們感官評價低的主要原因，更不易被消費者接受。因此考慮，選取3.00、5.00 和7.00 g/L 作為響應(yīng)面因素考察水平。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 三因素響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken 中心組合設(shè)計原理，進行三因素三水平RSM 分析試驗，分別考察Vc 濃度（A）、Nisin 濃度（B）和卡拉膠濃度（C）對白度值（Y）的影響，結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design of response surface experiment and results

2.3.2 響應(yīng)面方差分析

采用多元回歸擬合上述試驗結(jié)果，得到以白度值為目標(biāo)函數(shù)、各參數(shù)編碼值的多元二次方程：Y=86.18-0.06A+0.43B+0.83C-0.16AB-0.96AC+0.09 BC-3.35A2-1.68B2-2.44C2，對其進行顯著檢驗與方差分析，結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面方差分析Table 5 The variance analysis of response surface experiment

從表5 可知，該回歸模型p=0.0004＜0.01，表明二次回歸方程模型顯著；失擬項p=0.3865＞0.05，表明該回歸方程擬合度較高；R2=0.9868，表明模型可充分?jǐn)M合試驗數(shù)據(jù)，可用來預(yù)測復(fù)合生物保鮮劑最優(yōu)配方。通過該模型方差分析可知：在所有作用因素中，一次項 B 對雙孢蘑菇白度值影響顯著（p＜0.05），一次項C、交互項AC 和二次項A2、B2、C2對雙孢蘑菇白度值影響極顯著（p＜0.01），一次項A、交互項AB 和BC 對雙孢蘑菇白度值影響均不顯著（p＞0.05）。F 值大小表示各因素對試驗的影響程度，從表5 可知，對雙孢蘑菇白度值影響順序為：卡拉膠（C）＞Nisin（B）＞Vc（A）。

2.3.3 兩因素交互影響綜合評分響應(yīng)面分析

不同因素交互影響雙孢蘑菇白度值響應(yīng)面，見圖5～圖7。等高線形狀反映交互效應(yīng)強弱，其中橢圓形表示兩種因素交互作用顯著，圓形則表示兩種因素交互作用不顯著[35]。

Nisin 和Vc 雙因素交互作用對雙孢蘑菇白度值的影響見圖5。由此可知，Nisin 與Vc 交互作用對白度值影響是先上升后下降，整體圖像呈弧形。當(dāng)Nisin 濃度0.40 g/L、Vc 濃度0.80 g/L 時，白度值86.32，等高線接近圓形，表明A、B 兩種因素交互作用對雙孢蘑菇白度值影響不明顯。Nisin 和Vc 過多均會降低商品價值，過少則無明顯保鮮效果。

卡拉膠和Vc 雙因素交互作用對雙孢蘑菇白度值的影響見圖6。經(jīng)分析，卡拉膠與Vc 交互作用所產(chǎn)生的3D 圖像呈一個弧面，白度值隨兩者濃度增加而先升高后降低。當(dāng)卡拉膠濃度5.00 g/L、Vc 濃度0.80 g/L 時，白度值86.46，等高線為橢圓形，表明A、C 兩種因素交互作用對雙孢蘑菇白度值影響明顯，這是因為卡拉膠可作為基質(zhì)使Vc 附著在子實體表面，保證Vc 充分發(fā)揮抗氧化功能，從而起到穩(wěn)定持續(xù)的緩釋保鮮作用。

Nisin 和卡拉膠雙因素交互作用對雙孢蘑菇白度值的影響見圖7。圖7 表明Nisin 和卡拉膠兩者交互作用所構(gòu)成的3D 模型圖呈弧形。隨著兩者濃度的增加，白度值先升高后降低。等高線圖趨向橢圓形，表明交互作用顯著，并且要比卡拉膠和Vc 雙因素交互作用更顯著。當(dāng)Nisin 濃度0.40 g/L、卡拉膠濃度5.00 g/L 時，白度值最高?？ɡz同樣作為基質(zhì)會使Nisin 牢牢地附著在菇體表面，充分發(fā)揮緩釋效用，抑制大多數(shù)微生物生長和繁殖活動，持續(xù)保護菇體減輕微生物侵害作用。已有研究證明，以殼聚糖為基質(zhì)、Nisin 為抑菌成分的涂膜可以抑制PPO 和POD的活性，減緩貯藏過程中機體酚類物質(zhì)的損失，從而降低褐變程度，延緩白度值的下降[36]。

2.3.4 預(yù)測及驗證試驗結(jié)果

依據(jù)響應(yīng)面圖和等高線圖，清楚表明三因素不同濃度對雙孢蘑菇整體白度值產(chǎn)生的影響。通過對二次拋物線函數(shù)模型極值分析，得到天然復(fù)合生物保鮮劑最佳濃度條件：Vc 0.79 g/L、Nisin 0.42 g/L、卡拉膠5.36 g/L，在此最優(yōu)濃度條件下，白度值86.28。為進一步驗證響應(yīng)面分析結(jié)果的可靠性以及方便實際操作，選擇Vc 0.80 g/L、Nisin 0.40 g/L、卡拉膠5.40 g/L 作為最優(yōu)濃度。

響應(yīng)面驗證試驗結(jié)果如圖8，三組處理白度值在貯藏期0～8 d 內(nèi)均呈下降趨勢，且在整個貯藏期內(nèi)復(fù)合生物保鮮劑組白度值始終高于兩組對照，在第4、6 和8 d 達(dá)到顯著水平（p＜0.05），其中測得第8 d 雙孢蘑菇白度值86.10，并且高出BC 組9.00%，CK 組21.32%，與模型預(yù)測值接近。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的復(fù)合生物保鮮劑濃度準(zhǔn)確可靠并具有較好保鮮效果，可進行下一步雙孢蘑菇的品質(zhì)測定試驗。

2.4 品質(zhì)測定試驗結(jié)果

2.4.1 最優(yōu)配方對貯藏期雙孢蘑菇表觀指標(biāo)的影響

最優(yōu)配方對貯藏期雙孢蘑菇表觀指標(biāo)的影響結(jié)果見表6。由表6 可知，失重率、硬度和腐爛率均會隨著貯藏時間延長而發(fā)生相應(yīng)變化，這說明采后雙孢蘑菇依然進行著旺盛的生理代謝活動。復(fù)合生物保鮮劑處理組在貯藏期第2 d 開始至貯藏末期，其失重率（0.98%～4.75%）均顯著低于兩組對照（p＜0.05）；在硬度保持方面，CK 組硬度下降的最快，BC 組次之，復(fù)合生物保鮮劑組在中貯藏末期依然保持312.80 g 硬度水平并顯著（p＜0.05）；在腐爛率方面，復(fù)合生物保鮮劑處理組在貯藏期第4 d 剛出現(xiàn)腐爛的現(xiàn)象，較對照組推遲2 d，同時在整個貯藏期間，BC 組和CK 組腐爛率均顯著高于復(fù)合生物保鮮劑處理組（p＜0.05），尤其是第8 d，復(fù)合生物保鮮劑處理組僅為4.33%。以上試驗結(jié)果足以表明復(fù)合生物保鮮劑能夠降低雙孢蘑菇生理代謝水平，對子實體抗逆能力和新鮮度的保持具有積極意義。

表6 最優(yōu)配方對貯藏期雙孢蘑菇失重率、硬度和腐爛率的影響結(jié)果Table 6 Effects of optimal formula on weight loss,hardness and decay rate of Agaricus bisporus during storage

2.4.2 最優(yōu)配方對貯藏期雙孢蘑菇生理指標(biāo)的影響

2.4.2.1 PPO 活力的變化及分析

當(dāng)植物組織衰老或受損時，PPO 與底物亞細(xì)胞區(qū)域化被破壞使得PPO 被活化，與酚類物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)生成醌類物質(zhì)，進一步聚合生成黑褐色或深棕色沉積物，因此PPO 與組織褐變存在直接關(guān)系[22]。由圖9 不難看出，BC 組、CK 組和復(fù)合生物保鮮劑處理組PPO 活性隨貯藏時間延長均呈現(xiàn)先急速上升后緩慢上升趨勢，這與楊豐菊[37]研究真空滲透下不同鈣處理雙孢蘑菇中PPO 活性的反映大體一致，說明子實體內(nèi)PPO 在脅迫環(huán)境中有重要作用。整個貯藏期間，復(fù)合生物保鮮劑處理組PPO 活性始終顯著低于BC 組和CK 組（p＜0.05），特別是貯藏期2、4、6 d，PPO 活性幾乎不變，分別為5525.86、5861.21 和5914.43 U/g FW。復(fù)合生物保鮮劑處理組在貯藏前后僅上升了3406.39 U/g FW，上升幅度僅為CK 組的33.93%、BC 組的60.08%。由此可知，復(fù)合生物保鮮劑能夠有效延緩雙孢蘑菇貯藏期間PPO 活性的增加。

2.4.2.2 總酚含量的變化及分析

植物體內(nèi)存在某些次級代謝途徑能夠提高機體抗逆性，如苯丙烷代謝，其生成的酚類物質(zhì)、木質(zhì)素等有不同的抗逆活性[38]。苯丙氨酸酶（PAL）是苯丙烷代謝關(guān)鍵酶之一，其活性大小與酚類等物質(zhì)含量高低密切相關(guān)[39]。木質(zhì)素合成原料之一是酚類物質(zhì)[40]，木質(zhì)素有效積累會提高細(xì)胞抵抗病原菌侵染能力[41]。酚類物質(zhì)作為非酶抗氧化系統(tǒng)的底物，其含量可影響機體氧化損傷和褐變程度[42]。由圖10可以看出，在貯藏期內(nèi)，復(fù)合生物保鮮劑處理組、BC 組和CK 組的總酚含量均呈現(xiàn)先上升后下降規(guī)律，這和LI 等[43]研究L-精氨酸對雙孢蘑菇總酚含量的結(jié)果基本一致。不同的是，復(fù)合生物保鮮劑處理組在貯藏期第4 d 就已出現(xiàn)峰值（1.95 OD280/g FW），不僅快于BC 組和CK 組2 d，而且峰值含量分別是BC 組（1.69 OD280/g FW）和CK 組（1.58 OD280/g FW）的1.15 和1.58 倍并達(dá)到顯著性水平（p＜0.05）?？偡雍康脑黾涌赡苁怯蓮?fù)合生物保鮮劑抑制了PPO 活性導(dǎo)致的。不難看出，在貯藏期2～8 d 內(nèi)，復(fù)合生物保鮮劑處理組總酚含量均始終高于對照組（p＜0.05），并維持較高含量水平。從上述結(jié)果得知，復(fù)合生物保鮮劑處理可加快雙孢蘑菇貯藏期間總酚含量峰值出現(xiàn)并促進酚類物質(zhì)積累。

2.4.2.3 總抗氧化能力的變化及分析

植物遭遇不良脅迫時，其體內(nèi)會立即產(chǎn)生活性氧簇（ROS）[44]，少量ROS 會提高植物體抗菌能力[45]，過多ROS 就會損傷細(xì)胞[46]，但機體存在ROS清除系統(tǒng)，可及時清除過量ROS 從而保護細(xì)胞[47]。DPPH 自由基和ABTS 陽離子自由基清除率均為衡量ROS 清除系統(tǒng)總抗氧化能力的重要指標(biāo)。由圖11（A）知，在整個貯藏期間，所有試驗組DPPH自由基清除率均呈現(xiàn)逐漸下趨勢，但復(fù)合生物保鮮劑處理組始終顯著高于BC 組和CK 組（p＜0.05），它與對照組間差距在貯藏第4 d（81.55%）達(dá)到最大，高出BC 組22.23%以及CK 組22.34%，在貯藏第8 d 清除率依然高達(dá)66.08%，這表明復(fù)合生物保鮮劑處理可延緩DPPH 自由基清除能力的降低。由圖11b 可知，隨貯藏時間延長，三組處理的ABTS陽離子自由基清除率呈現(xiàn)先短暫上升后下降的趨勢。復(fù)合生物保鮮劑處理組ABTS 陽離子自由基清除率在貯藏第2、6、8 d 三個時間點均顯著高出對照組（p＜0.05），在貯藏期第2 d 達(dá)到峰值（90.34%），比BC 組峰值的出現(xiàn)提前2 d，并且下降速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照組。這說明復(fù)合生物保鮮劑處理能夠促進雙孢蘑菇貯藏期間ABTS 陽離子自由基清除率峰值出現(xiàn)，并且可有效延緩菇體抗氧化能力的降低。

3 結(jié)論

本研究以雙孢蘑菇為試驗對象，通過白度值和感官評價雙指標(biāo)擇優(yōu)篩選，研究了茶多酚、L-谷氨酸、L-精氨酸和Vc 對子實體的抗氧化能力，大蒜提取液、ε-聚賴氨酸、Nisin 和生姜提取液的抑菌保鮮效果，以及果膠、黃原膠、卡拉膠和水溶性殼聚糖的成膜保鮮效果。初步結(jié)果表明，Vc、Nisin 和卡拉膠有效延緩子實體褐變、保持一定新鮮度。在此基礎(chǔ)之上進一步研究，經(jīng)復(fù)合優(yōu)化得到的復(fù)合生物保鮮劑（Vc 0.80 g/L、Nisin 0.40 g/L、卡拉膠5.40 g/L），能夠有效延緩雙孢蘑菇硬度下降、失重率和腐爛率的上升，提高采后抗氧化能力，延緩酚類物質(zhì)含量和自由基清除能力的降低、抑制PPO 活力增加，延長貨架期3～4 d。但是本研究僅僅是在短期低溫條件下，通過復(fù)合生物保鮮劑處理，對雙孢蘑菇失重率、硬度、腐爛率、總酚含量、PPO 活性、DPPH 自由基和ABTS 陽離子自由基清除率的變化趨勢進行了研究，將來可對ROS 清除系統(tǒng)相關(guān)酶活性和營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化進行研究，還可以對這些變化產(chǎn)生的原因或機理展開更深入的研究，以便更加全面地解釋復(fù)合生物保鮮劑對雙孢蘑菇衰老的影響。