兩個普洱茶品種的代謝物比較分析

周泳臣，劉穎，鄭文忠，高峻*，趙一明，茶鳳官，丁海琴，孔勝，呂才有

（1.云南農(nóng)業(yè)大學茶學院，云南昆明 650201）

（2.云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)茶葉產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)栽培研究室，云南昆明650201）

（3.普洱茶樹良種場，云南普洱 665000）

四千多年前，中國就有了關(guān)于茶的記載[1]。目前茶樹已在世界范圍內(nèi)普遍栽培，茶每日消耗量巨大，水是第一大飲料，而茶是第二大飲料[2]。茶中富含大量可溶性物質(zhì)[3]，有茶氨酸、茶多酚、兒茶素、咖啡堿、有機酸和維生素等。茶有非常多的好處[4]，如抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化和降低膽固醇等。近年來，越來越多的人開始關(guān)心茶葉的品質(zhì)[5]。影響茶葉品質(zhì)的主要因素有茶葉的內(nèi)含物、采摘季節(jié)、加工工藝和儲存方式[6]等，其中與茶葉品種的內(nèi)含物關(guān)系最為密切?；诖?，鑒定出不同品種的茶葉內(nèi)含物對于其品質(zhì)的控制極其重要。

代謝組學是一種新起的技術(shù)手段[7]，目前，代謝組學的研究范圍覆蓋細胞代謝組學、藥物代謝組學、代謝性疾病的代謝組學、植物代謝組學領(lǐng)域[8]。代謝組學能夠更有效、更直觀、更準確、更系統(tǒng)地反映生物體在不同生態(tài)條件下的變化，在研發(fā)新藥[9]、診斷疾病[10]、分析轉(zhuǎn)基因作物[11]、食品安全[12]等領(lǐng)域具有廣泛的應用。代謝組學研究就是分析生物樣品中的代謝產(chǎn)物，并鑒定和篩選出具有研究價值的顯著差異代謝物，最后解釋這些差異物的代謝過程和機制[13]。在茶葉中，代謝組學技術(shù)廣泛應用于茶樹栽培、品種分類鑒別、茶葉加工工藝優(yōu)化、茶葉品質(zhì)控制、茶葉年份及品質(zhì)鑒別等[14]方面，對茶園土壤管理、茶樹育種的改良、提高茶樹抗逆性和嫁接砧穗的選擇等有著積極的作用。

在中國云南省普洱市普洱良種場，實驗人員通過群體選育的方式獲得了兩個當?shù)氐钠斩鑳?yōu)良品種，這兩個茶品種有著較高的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益，適應性較強，有一定的推廣價值，所具備的特點在普洱茶樹品種中具有一定的代表性。鑒于此，本研究利用代謝組學技術(shù)分析這兩個普洱茶品種的代謝差異，旨在為茶葉適制性和品質(zhì)控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

茶葉樣品于2020年9月底在中國云南省普洱市普洱良種場的茶園采摘，均為枝條上一芽二葉的嫩芽，采后立即用液氮冷凍保存在-80 ℃環(huán)境中，直到進一步實驗再取出進行研究。本次共采了兩個樣品，對應編號分別為B1 和B3，B1 代表品種1（桃形葉），B3代表品種3（云瑰），每個樣品有3 個重復。為了探索代謝物在不同樣本的差異，各樣品分組以及對應信息在表1 種列出。

表1 樣品信息及編號Table 1 Sample information and numbers

品種1（桃形葉）：又名木蘭1 號、云桃。在云南大葉種茶樹群體中通過系統(tǒng)選育技術(shù)得到的優(yōu)良品種，無性系，喬木型，中葉類，遲生種。在普洱和西雙版納等地有大量試種成功，且在國內(nèi)其他茶區(qū)均有推廣。春茶一芽二葉干樣含茶多酚30.6%、水浸出物44.8%。該品種耐旱力較強，但抗病蟲害能力一般，耐寒能力弱，且熟地適栽性差。

品種3（云瑰）：在云南大葉種茶樹群體中通過系統(tǒng)選育技術(shù)得到的優(yōu)良品種，無性系，植株高大，樹姿開張，分枝角度大，低位分枝多，葉片稍上斜狀著生，葉長橢圓形，葉色深綠，葉身稍內(nèi)折，葉緣微波，葉尖漸尖，葉齒深而明顯，葉色綠，葉背茸毛密集，芽肥壯。春茶一芽二葉蒸青樣含茶多酚34.10%、兒茶素190.27 mg/g、咖啡堿4.25%、水浸出物48.61%。該品種抗逆性強，生熟地適栽性較好。

1.2 標準品與試劑

甲醇（色譜純），Merck 品牌；乙腈（色譜純），Merck 品牌；標準品（色譜純），BioBioPha/Sigma-Aldrich 品牌。

1.3 實驗流程

實驗流程見圖1。

1.4 樣品提取流程

（1）生物樣品放置于凍干機（Scientz-100F）中真空冷凍干燥；

（2）利用研磨儀（MM 400，Retsch）研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；

（3）稱取100 mg 的粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；

（4）每30 min 渦旋一次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6 次，樣本置于4 ℃冰箱過夜；

（5）離心（轉(zhuǎn)速12000r/min，10 min）后，吸取上清，用微孔濾膜（0.22 μm pore size）過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析。

1.5 色譜、質(zhì)譜條件

本研究利用超高效液相色譜（UPLC）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）對數(shù)據(jù)進行采集。

1.5.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流動相A：超純水（加入0.1%的甲酸）；流動相B：乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脫梯度：0 min B 相比例為5%，直到9 min，B 相比例線性增加至95%，同時持續(xù)95% 1 min，10～11 min，B 相比例驟降至5%，直至14 min，一直保持在5%；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量4 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件

LIT 和三重四極桿（QQQ）掃描是在三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（Q TRAP），AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統(tǒng)上獲得的，該系統(tǒng)配備了ESI Turbo離子噴霧接口，可由Analyst 1.6.3 軟件（AB Sciex）控制運行正負兩種離子模式。ESI 源操作參數(shù)如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓（IS）5500 V（正離子模式）/-4500 V（負離子模式）；離子源氣體I（GSI），氣體II（GSII）和簾氣（CUR）分別設(shè)置為50、60 和25.0 psi，碰撞誘導電離參數(shù)設(shè)置為高。在QQQ 和LIT 模式下分別用10 和100 μmol/L聚丙二醇溶液進行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準。QQQ 掃描使用MRM 模式，并將碰撞氣體（氮氣）設(shè)置為中等。通過進一步的DP 和CE 優(yōu)化，完成了各個MRM 離子對的DP 和CE。根據(jù)每個時期內(nèi)洗脫的代謝物，在每個時期監(jiān)測一組特定的MRM 離子對。

1.6 代謝物定性定量原理

利用數(shù)據(jù)庫MWDB（metware database），使用二級譜信息對化合物定性，在分析時過濾掉同位素信息，其中包括K+離子、Na+離子、NH4+離子的重疊信息，還有本身為其他更大分子量化合物的碎片分子的重疊信息。

本研究采用了三重四級桿質(zhì)譜的多反應監(jiān)測模式（MRM）對代謝物進行定量分析。MRM 模式中，四級桿先檢測目標物的前體分子（母離子），再剔除掉與其他分子量物質(zhì)對應的分子以初步排除干擾;而前體分子在經(jīng)碰撞室的誘導電離后斷裂產(chǎn)生了很多碎片離子碎片離子再通過三重四級桿過濾選擇出所需要的一個特征碎片離子，排除非目標離子干擾，使定量更為精準，獲得更好的重復性。最后將得到的各個樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)進行所有質(zhì)譜峰的峰面積積分，并完成質(zhì)譜峰的校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物定性定量分析

利用軟件Analyst 1.6.3 處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。下圖所示為混樣質(zhì)控QC 樣本的總離子流圖（Total ions current，TIC，即每個時間點質(zhì)譜圖中所有離子的強度加和后連續(xù)描繪得到的圖譜）及MRM 代謝物檢測多峰圖（多物質(zhì)提取的離子流譜圖，XIC），橫坐標為代謝物檢測的保留時間（Retention time，Rt），縱坐標為離子檢測的離子流強度（強度單位為cps，count per second）。結(jié)果見圖2 和圖3。

基于數(shù)據(jù)庫MWDB（metware database），對樣本的代謝物進行了質(zhì)譜定性定量分析。圖中多反應監(jiān)測模式MRM 代謝物檢測多峰圖展示了樣本中能夠檢測到的物質(zhì)，每個不同顏色的質(zhì)譜峰代表檢測到的一個代謝物。通過三重四級桿篩選出每個物質(zhì)的特征離子，在檢測器中獲得特征離子的信號強度（CPS），用Multia Quant 軟件打開樣本下機質(zhì)譜文件，進行色譜峰的積分和校正工作，每個色譜峰的峰面積（Area）代表對應物質(zhì)的相對含量，最后導出所有色譜峰面積積分數(shù)據(jù)保存。為了比較所有檢測到的代謝物中每個代謝物在不同樣本中的物質(zhì)含量差異，根據(jù)代謝物保留時間與峰型的信息，對每個代謝物在不同樣本中檢測到的質(zhì)譜峰進行校正，以確保定性定量的準確。圖4 展示了隨機抽取的代謝物在不同樣本中的定量分析積分校正結(jié)果，橫坐標為代謝物檢測的保留時間（min），縱坐標為某代謝物離子檢測的離子流強度（cps）。

2.2 代謝物的定性定量分析-QC

質(zhì)控樣本（QC）由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復性。在儀器分析的過程中，每10 個檢測分析樣本中插入一個質(zhì)控樣本，以監(jiān)測分析過程的重復性。QC 樣本質(zhì)譜檢測的正負離子模式的TIC 重疊圖如圖5 和圖6 所示，橫坐標表示代謝物檢測的保留時間，縱坐標表示離子檢測的離子流強度。結(jié)果表明質(zhì)控樣本（QC）TIC 重疊圖中曲線的重疊性高，無干擾信號，儀器具有較高的穩(wěn)定性，檢測結(jié)果可靠。

2.3 主成分分析-PCA

PCA 可了解不同樣品間的變異度大小，PCA Plot不同樣品間代謝物的分離趨勢。主成分分析可解釋變異圖的橫坐標表示各個主成分，縱坐標表示可解釋變異，左圖為各個主成分相加所占的比例圖，累計可解釋變異，右圖為各個主成分的方差比例，每一點對應著PC1 至PC5，左圖的PC1 則對應著右圖的PC1，左圖的PC2 縱坐標值等于右圖的PC1 貢獻率加上PC2貢獻率，左圖的PC3 縱坐標值等于右圖中PC1、PC2和PC3 之和，依次類推，當左圖中PC5 對應的縱坐標值越接近1，則PCA 的模型越可靠。

樣品B1 和B3，對應的代謝物譜明顯分離，前兩個主要成分（PC1 和PC2）分別為66.4%和9.71%，PC1 值較大，說明B1 和B3 具有較大差異，且圖中PC5 接近于1，且主成分貢獻率PC1＞PC2＞PC3＞PC4＞PC5，說明PCA 模型解釋率很好，如圖7 和圖8所示。

2.4 OPLS-DA 分析

利用OPLS-DA 模型分析所得的數(shù)據(jù)，制出樣品B1 和B3 的得分圖，更加清晰地表示B1 和B3 的代謝物差異。在OPLS-DA 得分圖中，橫坐標表示預測主成分，可以看出重復樣的差異；縱坐標方向表示正交主成分，可看出樣品間的差距。如圖9 所示，B1 和B3 完全分離開來，說明OPLS-DA 可以很好地區(qū)分樣品B1 和B3。

OPLS-DA 的S-plot 圖能直觀地展示每個代謝物的貢獻率，它可以比較直觀地呈現(xiàn)出樣品間的顯著差異代謝物。代謝物在模型中各組樣品分類甄別中的影響強度用VIP 值表示。圖中紅色的點代表顯著差異代謝物，VIP 值大于等于1；綠色的點代表每個樣品都含有的通用代謝物，VIP 值小于1。如圖10 所示為樣品B1 和B3 的OPLS-Slopt 圖。

2.5 差異代謝物的聚類分析

為找出影響茶葉品質(zhì)比較大的化學成分，可對代謝物在不同樣本的積累模式進行聚類分析。橫向為樣品名稱，縱向為代謝物信息，Group 為分組，不同顏色為相對含量標準化處理后得到的數(shù)值。如圖11 所示，根據(jù)各樣品差異物的聚類熱圖分析，B1 和B3 對比有著明確的高表達或低表達的區(qū)域。

2.6 差異代謝物的篩選鑒定與分析

鑒于本研究結(jié)果具有生物學重復，故選擇FC 和VIP 值相結(jié)合的方法來選取差異代謝物，并要求同時符合FC≥2 或FC≤0.5 和VIP≥1 兩個要求。

火山圖上能夠很直接地看到樣品B1與B3的代謝物差異，圖中的點均有與其一一對應的代謝物。綠色點為下降的差異代謝物，紅色點為上升的差異代謝物，灰色點為區(qū)別較不明顯的代謝物。如圖12 所示，是樣品B1 和B3 的不同代謝物火山示意圖。

樣品B1 共檢測和定量了798 種代謝物，樣品B3共檢測和定量了802 種代謝物。如圖12 所示，與B3相比，B1 的代謝產(chǎn)物中有202 種顯著變化的代謝物（SCMs），其中108 種SCMs 的豐度顯著降低，而94種顯著增加。根據(jù)表2，這些SCMs 按照數(shù)量的多少通?？梢苑譃辄S酮、酚酸類、脂質(zhì)、氨基酸及其衍生物、其他類、木脂素和香豆素、有機酸、生物堿、核苷酸及其衍生物和鞣質(zhì)，差異代謝物的上調(diào)或下調(diào)數(shù)量，展示在圖13 中。

表2 樣品B1 和B3 差異代謝物Table 2 The differential metabolites of sample B1 and B3

2.7 總體的代謝通路分析

差異代謝物在生物體內(nèi)相互作用，如圖14 所示為樣品B1 和B3 的KEGG 差異代謝物分類圖。對樣品B1 和B3 的路徑分析表明，差異代謝物在49 條KEGG通路中富集，大多數(shù)已經(jīng)鑒定的差異代謝物存在于苯丙烷類生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮的生物合成、黃酮及黃酮醇的生物合成及氨基酸的生物合成等途徑中。

3 討論

劉海燕等[15]概述了黃酮具有很強的抗氧化效果，可將體內(nèi)的自由基清除，減緩細胞的退化，達到抗衰老的作用。黃酮有著很多的保健功效，可降膽固醇，抗病毒，增強免疫力等。因此，黃酮對茶葉非常的重要。在本研究實驗中，品種1（桃形葉）共檢測到209種黃酮類物質(zhì)，品種3（云瑰）共檢測到211 種黃酮類物質(zhì)。其中品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）相比，有37 種黃酮類物質(zhì)是含量較多的，有54 種黃酮類物質(zhì)是含量較少的。從黃酮對茶葉的影響來看，品種3（云瑰）制茶的品質(zhì)較好。

龔雨順等[16]認為茶葉中酚酸主要有沒食子酸、鞣花酸、咖啡酸、間雙沒食子酸、對香豆酸、茶沒食子素、對香豆酰-3-奎尼酸，它們的生物活性對茶葉非常的重要，同時也有著非常高的生物利用度。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，品種1（桃形葉）共檢測到130 種酚酸類物質(zhì)，品種3（云瑰）共檢測到131 種酚酸類物質(zhì)，其中品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）相比，有11 種酚酸類物質(zhì)是含量較多的，有25 種酚酸類物質(zhì)是含量較少的。因此，品種3（云瑰）的酚酸類含量較高，品質(zhì)較好。

趙燕妮等[17]利用脂質(zhì)組學的方法對黑茶和杜仲葉生殖生長的不同階段內(nèi)含脂類成分的變化規(guī)律進行研究，指出脂類物質(zhì)對茯茶香氣的形成有著積極的作用，其理論依據(jù)對茯茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展和品質(zhì)改善有著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）都檢測到93 種酚酸類物質(zhì)，其中品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）相比，有20 種酚酸類物質(zhì)是含量較多的。所以品種1（桃形葉）比品種3（云瑰）在酚酸類物質(zhì)的含量上更有優(yōu)勢，對茶葉香氣等品質(zhì)的形成更有幫助。

黃秀瓊[18]研究表明，春季黃金茶1 號比春季適制綠茶的品種碧香早氨基酸要高，更適合制綠茶，說明氨基酸與茶葉的適制性密切相關(guān)。通過代謝組學研究，發(fā)現(xiàn)品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）都檢測到83種氨基酸及其衍生物，其中品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）相比，有6 種氨基酸及其衍生物是含量較多的，有7 種氨基酸及其衍生物是含量較少的。故品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）二者之間的氨基酸及其衍生物的含量差別不大，從氨基酸及其衍生物的含量方面分析不能很好地比較茶葉的適制性。

王春波等[19]利用代謝組學技術(shù)對不同產(chǎn)地都勻毛尖茶的代謝差異進行了分析，鑒定出咖啡堿在小圍寨團山產(chǎn)地的樣品中含量最高，可作為區(qū)分都勻毛尖茶產(chǎn)地的科學依據(jù)，同時也指出咖啡堿對茶湯的爽口感起著積極的作用，能與茶湯中的兒茶素等物質(zhì)發(fā)生反應，進而改變茶湯的滋味。本實驗研究同樣通過代謝組學技術(shù)對不同品種的普洱茶進行分析，結(jié)果表明品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）的咖啡堿含量差異不明顯。故品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）對茶湯滋味的影響程度不能很好的區(qū)分。

4 結(jié)論

中國制茶有著悠久的歷史，隨著市場的不斷發(fā)展，制茶工藝也在不斷的改進，茶葉品質(zhì)也在不斷地符合人們的不同需求。影響茶葉品質(zhì)的主要因素有茶葉的內(nèi)含物、采摘季節(jié)、加工工藝和儲存方式等，其中茶葉的內(nèi)含物對茶葉不同品質(zhì)的形成影響最大。本研究采用代謝組學技術(shù)分析了兩個不同品種的普洱茶代謝物差異，結(jié)果表明，品種1（桃形葉）共檢測和定量了798 種代謝物，品種3（云瑰）共檢測和定量了802種代謝物，二者之間有202 種顯著變化的代謝物（SCMs），品種1（桃形葉）較品種3（云瑰）有108種SCMs 的豐度顯著降低，而有94 種顯著增加。這些SCMs 按照數(shù)量的多少通?？梢苑譃辄S酮、酚酸類、脂質(zhì)、氨基酸及其衍生物、其他類、木脂素和香豆素、有機酸、生物堿、核苷酸及其衍生物和鞣質(zhì)。且差異代謝物在49 條KEGG 通路中富集，大多數(shù)已經(jīng)鑒定的差異代謝物存在于苯丙烷類生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮的生物合成、黃酮及黃酮醇的生物合成及氨基酸的生物合成等途徑中。這些代謝物的數(shù)量和差異分析可為人們根據(jù)不同的需求而選擇不同的茶葉品種進行制茶和品質(zhì)控制提供理論依據(jù)和科學指導。