枯草芽孢桿菌脂肪酶LipA 的生物信息學(xué)分析

黎菁菁，賴昕玨，李鑫堯，馬俊煒，余銘怡，羅佳偉，陳胤熹，余潔婷，鄭少鵬，鄭敦錦，曹詩林*，陳宛涓

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院廣東省食品智能制造重點實驗室，廣東佛山 528000）

（2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528000）

（3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院材料科學(xué)與氫能學(xué)院，廣東佛山 528000）

脂肪酶，是一類能特異性地在油水界面上水解三脂酰甘油酯鍵的酶[1]，廣泛存在于微生物、人體、動物以及植物中。目前最常見的脂肪酶生產(chǎn)方式為微生物發(fā)酵法，其次還有提取法。由于微生物具有繁殖速度快、種類多的特性，其產(chǎn)生的脂肪酶種類多，具有較強的穩(wěn)定性、底物特異性，水解作用的溫度和pH范圍更廣[2]，并且大多數(shù)的脂肪酶為胞外酶[3]，使得更方便快捷地在工業(yè)生產(chǎn)中得到純度較高的酶制劑，因此微生物發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶已成為工業(yè)生產(chǎn)脂肪酶的主要途徑，有關(guān)微生物脂肪酶生產(chǎn)的相關(guān)研究也越來越多。

枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，由于其具有非致病性、分泌能力較強以及發(fā)酵工藝成熟等優(yōu)勢，已成為進行基因研究及其表達的一種重要的工具系統(tǒng)，在基因工程中也有深入的研究[4,5]?？莶菅挎邨U菌能夠產(chǎn)生的使脂類水解的酶主要有三種，分別是脂肪酶（LipA）、磷脂酶以及酯酶（LipB），其中脂肪酶（LipA）是由lipA 基因編碼的胞外水解酶，能夠較好地水解中等長度鏈長脂肪酸形成的酯鍵，在食品、醫(yī)藥、化妝品等多個領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[6,7]?？莶菅挎邨U菌脂肪酶LipA 結(jié)構(gòu)基因全長為636 bp，能夠編碼212個氨基酸，并組裝成分子量為22644 u 的脂肪酶前體，枯草芽孢桿菌所產(chǎn)生的脂肪酶（LipA）中缺乏半胱氨酸殘基，難以形成二硫鍵穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，并缺乏多數(shù)脂肪酶普遍存在的蓋子結(jié)構(gòu)[8]。此外，LipA 序列中含有A-X-S-X-G 保守序列。目前，對LipA 的研究主要集中于分泌途徑、催化機理、酶學(xué)性質(zhì)、固定化提高酶活力以及通過基因工程改變其立體選擇性、熱穩(wěn)定性與提高酶產(chǎn)量[9,10]。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法對枯草芽孢桿菌脂肪酶LipA 的基本結(jié)構(gòu)、基本特性、模體、表面電位、可及性等進行系統(tǒng)分析，為后續(xù)的LipA的分子設(shè)計和改造工作提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

LipA 的氨基酸序列來源于美國國家生物信息中心NCBI，GenBank 登錄號：ACA60974.1。

1.2 LipA 性質(zhì)預(yù)測

LipA 的親/疏水性分析：使用ProtScale 在線程序[11]對親/疏水性預(yù)測，并對疏水性最強的區(qū)域及其親水性最強的區(qū)域進行分析。

LipA 的基本特性預(yù)測分析：使用ProtParam 在線程序[12]對LipA 的不穩(wěn)定指數(shù)、消光系數(shù)、脂溶指數(shù)、平均親水性進行預(yù)測。

LipA 表面電位預(yù)測：使用軟件Swiss-Pdb-viewer 4.1.0[13]對LipA 蛋白質(zhì)表面靜電構(gòu)象進行建模。

LipA 的可及性分析：使用軟件Swiss-Pdb-viewer 4.1.0 對LipA 蛋白質(zhì)的可及性模型進行建模。

1.3 LipA 結(jié)構(gòu)預(yù)測

LipA 一級結(jié)構(gòu)分析：使用ProtParam 在線程序?qū)A性氨基酸、酸性氨基酸個數(shù)、相對質(zhì)量及其等電點、氨基酸含量進行預(yù)測。

LipA 二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測：使用NPSA 在線網(wǎng)站所提供的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測程序[14]，用SOPM 的預(yù)測方法分析二級結(jié)構(gòu)中的α螺旋、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)。

LipA 的特殊卷曲螺旋預(yù)測：使用COILS 在線程序[15]對LipA 的卷曲螺旋區(qū)域進行分析，通過在線網(wǎng)址Multicoil Scoring Form[16]對LipA 的二聚體、三聚體卷曲螺旋進行預(yù)測。

LipA 的模體預(yù)測：使用MotifScan 在線網(wǎng)站[17]對脂肪酶LipA 蛋白序列進行模體預(yù)測。

LipA 的PEST 序列預(yù)測：使用epestfind 程序[18]預(yù)測LipA 的PEST 序列。

LipA 的三級結(jié)構(gòu)分析：通過在線工具trRosetta在線程序[19,20]對脂肪酶LipA 進行建模，選取最合理的模型，用Pymol 軟件對LipA 進行可視化分析，使用PSIPRED 在線程序[21]分析α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲3 種結(jié)構(gòu)的數(shù)目。

LipA 的 Ramachandran 圖分析：使用軟件Swiss-Pdbviewer 4.1.0 獲得Ramachan-dran Plot（拉氏構(gòu)象圖），并使用PROCHECK 在線網(wǎng)址[22]分析得到其區(qū)域數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019 對模體預(yù)測數(shù)據(jù)進行歸納處理，使用PowerPoint 2019 對二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、表面電位、可及性和Ramachandran 圖分析的圖片進行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 LipA 一級結(jié)構(gòu)分析

使用在線程序ProtParam 進行預(yù)測，得出其相對分子質(zhì)量為22664.02，預(yù)測其等電點pI=9.57。20 種氨基酸中的含量排序依次是甘氨酸Gly（11.3%）、纈氨酸Val（9.9%）、亮氨酸Leu（9.9%）、天冬酰胺Asn（8%）、絲氨酸Ser（8%）、丙氨酸Ala（7.5%）、賴氨酸Lys（6.6%）、異亮氨酸Ile（5.7%）、蘇氨酸Thr（5.7%）、天冬氨酸Asp（4.2%）、酪氨酸Tyr（4.2%）、谷氨酰胺Gln（3.3%）、精氨酸Arg（2.8%）、甲硫氨酸Met（2.8%）、組氨酸His（2.4%）、脯氨酸Pro（2.4%）、苯丙氨酸Phe（2.4%）、谷氨酸Glu（1.4%）、色氨酸Trp（0.9%）、半胱氨酸Cys（0.5%）。

LipA 的本質(zhì)是由氨基酸為基本單位構(gòu)成的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的酸堿性是其重要的理化性質(zhì)之一。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、生理功能和作用機制的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是根據(jù)遺傳密碼編碼的氨基酸通過肽鍵結(jié)合形成的多肽鏈，蛋白質(zhì)側(cè)鏈上含有的酸性氨基酸和堿性氨基酸上帶有可解離的基團，這些可解離基團可以決定蛋白質(zhì)的酸堿性，因此蛋白質(zhì)的酸堿性可依賴于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中酸性氨基酸和堿性氨基酸的數(shù)量之比[23]。蛋白質(zhì)的等電點與氨基酸的組成、屬性和分子量的分布有關(guān)。蛋白質(zhì)側(cè)鏈可電離氨基酸的pKR 值可影響蛋白質(zhì)的等電點，即酸性氨基酸和堿性氨基酸側(cè)鏈上的氨基和羧基的電離常數(shù)與蛋白質(zhì)的等電點有關(guān)[24]。根據(jù)ProtParam 的預(yù)測結(jié)果顯示，脂肪酶LipA 呈堿性，由212 個氨基酸構(gòu)成，其中包含25 個堿性氨基酸和12 個酸性氨基酸，等電點pI=9.57，而微生物脂肪酶的等電點多為酸性，如疏棉狀嗜熱絲孢菌的脂肪酶等電點為4.4、白地霉脂肪酶的等電點為5.39[25,26]。

2.2 LipA 的親/疏水性分析

用在線程序ProtScale 對脂肪酶LipA 進行親/疏水性預(yù)測，確定最大親水值和最大疏水值及其相對應(yīng)的位置。根據(jù)負值越大表示蛋白親水性越強、正值越大表示蛋白疏水性越強，可知第12 位的纈氨酸正值最大為3.111，在12 個區(qū)域具有疏水性，LipA 疏水性最強的區(qū)域在Val9～Leu17 區(qū)間；第78 位的蘇氨酸負值最大為-2.333，LipA 親水性最強的區(qū)域在Lys75～Asn81區(qū)間，如圖1 所示。

氨基酸的親、疏水性分布對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生理功能有著重要意義。親水性和疏水性氨基酸可以預(yù)測跨膜蛋白的位置，構(gòu)成疏水的二級結(jié)構(gòu)，便于蛋白質(zhì)跨膜、形成更高級結(jié)構(gòu)，同時疏水氨基酸的疏水基團還可以促使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的折疊[27]。根據(jù)預(yù)測結(jié)果可知疏水性最強區(qū)域與其他天然脂肪酶一樣在N 端，這可能與蛋白質(zhì)的定位與分泌有關(guān)。

2.3 LipA 的基本特性預(yù)測分析

使用在線程序ProtParam對LipA的基本特性預(yù)測分析。結(jié)果表明LipA 的不穩(wěn)定指數(shù)為19.12，可知其屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)；在280 nm 波長下消光系數(shù)為24410M-1cm-1；脂溶指數(shù)為96.98；平均親水性是0.009。

蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性受到許多因素的影響，若要預(yù)測蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性可以用蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)低于40 時，則為穩(wěn)定性蛋白質(zhì)，相反，不穩(wěn)定指數(shù)高于40 則為不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)[28]。通過在線程序ProtParam 預(yù)測得到LipA 的不穩(wěn)定指數(shù)為19.12，因此LipA 屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，具有一定的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)的消光系數(shù)是指蛋白質(zhì)對某波長的光的吸收能力的量度，與半胱氨酸的組成比例有一定的關(guān)系[29]，由于LipA 僅有一個半胱氨酸殘基，蛋白中不存在二硫鍵，因此LipA 在280 nm 波長下消光系數(shù)只有24410 M-1cm-1。脂溶指數(shù)為96.98（＜100），并且平均親水性是0.009，可知LipA 是屬于脂溶性蛋白質(zhì)[30]。

2.4 LipA 二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要是指蛋白質(zhì)的多肽鏈主鏈上規(guī)則卷曲或折疊的構(gòu)象，利用NPSA 在線軟件對脂肪酶LipA 的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，統(tǒng)計其中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲分別對應(yīng)的百分比，結(jié)果表明，二級結(jié)構(gòu)中組分含量從大到小排序均為α-螺旋（29.72%）＞無規(guī)則卷曲（29.25%）＞β-延伸鏈（26.42%）＞β-轉(zhuǎn)角（14.62%）。（圖2）

LipA 的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測得知LipA 含有α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角等四種結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋和無規(guī)則卷曲的占比較大，分別為29.72%和29.25%，推測其空間結(jié)構(gòu)較小，且受到側(cè)鏈間相互作用較大的影響，而β-延伸鏈能夠進一步形成β-折疊結(jié)構(gòu)且占比達26.42%，其二級結(jié)構(gòu)比例符合α/β類蛋白的特征，與絕大多數(shù)的微生物脂肪酶相似[31,32]。同時，LipA 的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)Ser77、Asp133 和His156 與其他的第一家族脂肪酶相似，例如銅綠假單胞菌PA01 脂肪酶的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)為Ser82、Asp229 和His251[33]。已有研究表明LipA 具有耐堿性強，無界面活性等特點，且由于缺乏蓋子結(jié)構(gòu)，其活性中心暴露，因此不需經(jīng)過界面活化即能進行催化作用，但同時野生型的LipA也存在著熱穩(wěn)定性差、表達量低等問題[9]。與之相比，大多數(shù)的微生物脂肪酶如米根霉脂肪酶、白地霉脂肪酶等都具有蓋子結(jié)構(gòu)以及界面活化現(xiàn)象，蓋子結(jié)構(gòu)中的α-螺旋的親水/親油性的強弱會影響底物與蓋子結(jié)構(gòu)的結(jié)合，影響活性部位的打開，進而影響脂肪酶的催化活性，而界面活化作用則是通過提高活性部位附近的疏水性使活性部位暴露，影響脂肪酶的催化作用[34,35]，后續(xù)對LipA 的改造可以從提高表達量及熱穩(wěn)定性等方面進行。

2.5 LipA 的特殊卷曲螺旋預(yù)測

通過COILS 算法將LipA 的序列與已知的卷曲螺旋數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比較，得出相似性得分，并計算出相應(yīng)的卷曲概率，結(jié)果LipA 的卷曲概率均小于0.5，不存在卷曲螺旋區(qū)域；同時LipA 的二聚體、三聚體卷曲螺旋預(yù)測分值皆為0，不能形成穩(wěn)定的二聚體、三聚體卷曲。

2.6 LipA 的模體預(yù)測

使用MotifScan軟件對LipA蛋白序列進行模體預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白可能存在的翻譯后修飾位點有3 種，其中包括2 個蛋白激酶C 磷酸化位點、2 個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、8 個N-肉豆蔻?；稽c；可參與磷酸化、?；壬锘瘜W(xué)反應(yīng)。LipA 的模體名稱、序列號、類型及其氨基酸序列的位置信息如表1 所示。

表1 LipA 的模體預(yù)測Table 1 The motif prediction of LipA

2.7 LipA 的PEST 序列預(yù)測

使用在線網(wǎng)址EMBOSS 的epestfind 程序進行預(yù)測LipA 的PEST 序列，無得分低于閾值5.0 的序列，可知在脂肪酶LipA 上不存在非PEST 序列。PEST 序列是富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、絲氨酸（S）和蘇氨酸（T）的相對保守的特征序列[36]，并且PEST序列可以通過泛素蛋白酶體途徑加速蛋白的降解[37]，PEST 序列可能還存在其他的生理功能，但具體的作用機制尚未明確，而脂肪酶LipA 上不存在非PEST序列，可能具有較強的降解蛋白的能力。

2.8 LipA 的三級結(jié)構(gòu)分析

通過在線工具trRosetta 對脂肪酶LipA 進行建模，使用Pymol 視圖軟件進行圖像顯示，得到LipA 的三級結(jié)構(gòu)圖（圖3a），其中能清晰的看見其結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲3 種結(jié)構(gòu)，圖中紅色、黃色、綠色分別代表α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲。結(jié)果顯示其結(jié)構(gòu)中包含了5 段α-螺旋、6 段β-折疊，因此脂肪酶LipA 屬于典型的α/β類蛋白，其中無規(guī)則卷曲（包括β-轉(zhuǎn)角）的作用是連接α-螺旋或β-折疊。

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是在蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步盤旋、折疊形成的，是蛋白質(zhì)具有生物活性的基礎(chǔ)，其常用的結(jié)構(gòu)表征的方法包括近紫外圓二色譜、X-射線衍射、熒光光譜和核磁共振等[38]。LipA的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)構(gòu)顯示LipA 三級結(jié)構(gòu)中包含5 段α-螺旋、6 段β-折疊和豐富的無規(guī)則卷曲，而自然界中的脂肪酶一般為α/β類蛋白[39]，因此LipA 的預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果基本一致，與同類脂肪酶的結(jié)構(gòu)一致。

2.9 LipA 表面電位預(yù)測

使用軟件Swiss-Pdb-viewer 4.1.0 對LipA 蛋白質(zhì)表面靜電構(gòu)象進行建模的結(jié)果（見圖3b）。圖中分布著藍色和紅色兩種結(jié)構(gòu)，前者代表正電勢，后者代表負電勢。由圖可知，藍色的正電勢集團分散分布，占據(jù)了大部分的位置，紅色的負電勢集團相對集中，占據(jù)較少的位置但基團較大，使得LipA 整體呈弱正電勢。

蛋白質(zhì)的電荷密度目前大多通過分子帽分割法進行研究[40]，而蛋白質(zhì)的電勢分布能夠影響蛋白質(zhì)在帶電表面的吸附行為[41]，通過LipA 的表面電位預(yù)測構(gòu)象可知LipA 的正電勢基團的分布相對分散，而負電勢基團分布相對集中，LipA 整體上呈弱正電勢，這結(jié)果對于后續(xù)研究LipA 的分子表面吸附和電位差異有一定的意義。

2.10 LipA 的可及性分析

LipA 可及性模型的建模結(jié)果（圖3c），一般情況下，處于分子表面的氨基酸殘基（尤其是帶正電荷的賴氨酸和精氨酸）的可及性較大,深埋于分子內(nèi)部的殘基可及性很小。判斷氨基酸殘基與溶劑的接觸程度的強弱可以通過觀察其顏色的強弱程度（黃色＞綠色＞藍色）。

蛋白質(zhì)的可及性反映了蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基與水或其他溶劑接觸的可能性[42]，通過建模發(fā)現(xiàn)LipA的表面氨基酸殘基與水分子接觸的可及性大，而LipA內(nèi)部的氨基酸殘基可及性小，這說明可及性的大小與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系，對于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有重要意義。

2.11 LipA 的Ramachandran 圖分析

為了判斷LipA 的構(gòu)像合理性，本研究利用軟件Swiss-Pdbviewer 4.1.0 進行拉氏分析得到Ramachandran Plot（拉氏構(gòu)象圖）見（圖3d）。如坐標圖中藍線內(nèi)區(qū)域內(nèi)為一般允許區(qū)，藍線外的區(qū)域為不允許區(qū)。一般而言，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型中如果有超過90%的二面角位于一般允許區(qū)，則其空間結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定性。LipA 的結(jié)果（圖3d）表明：拉式圖中最合理區(qū)（黃線內(nèi)）和一般允許區(qū)（藍線內(nèi)）以及不允許區(qū)（藍線外）的殘基數(shù)占比分別為91.7%、7.2%和1.1%，在允許區(qū)內(nèi)總計占98.9%（大于90%），由此可知，利用trRosetta 進行建模得到的LipA 的模型是合理和可靠的。

Ramachandran 圖可以用于描述蛋白質(zhì)的主鏈碳的ψ角與Ф角所產(chǎn)生的低能構(gòu)象，如果沒有任何非鍵合原子間距離小于短接觸準則的限制距離，則（φ，ψ）值被認為是允許的或無空間沖突的，Ramachandran 圖還定義了蛋白質(zhì)骨架的可訪問構(gòu)象空間的限制[43]，因此Ramachandran 圖可用于判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的合理性。對LipA 的Ramachandran 圖進行分析，得到LipA 的ψ角與Ф角的98.9%位于Ramachandran 的允許區(qū)，這說明通過建模得到的LipA 的三維構(gòu)象具有科學(xué)性、合理性和可靠性。

3 結(jié)論

使用生物信息學(xué)方法分析LipA 的結(jié)構(gòu)特性與蛋白質(zhì)特性，得出枯草芽孢桿菌脂肪酶LipA 由212 個氨基酸組成，等電點為9.57，呈堿性；親、疏水性最強的區(qū)域分別為Lys75～Asn81 和Val9～Leu17，該區(qū)域發(fā)生突變時可能會影響蛋白質(zhì)的折疊，進而影響其結(jié)構(gòu)與生理功能；其不穩(wěn)定指數(shù)、脂溶指數(shù)和平均親水性表明LipA 屬于穩(wěn)定的脂溶性蛋白質(zhì)；但不存在穩(wěn)定的二聚體、三聚體卷曲螺旋；有3 個不同的模體，可能參與了不同的生化反應(yīng)；不存在非PEST 序列，可能具有較強的降解蛋白的能力；有5 段α-螺旋、6段β-折疊，屬于典型的α/β類蛋白；整體呈弱正電勢；LipA 的可及性和Ramachandran 圖表明建模得到的三維結(jié)構(gòu)是合理、可靠的。LipA 與其他微生物脂肪酶的不同之處主要在于其缺乏蓋子結(jié)構(gòu)，活性中心暴露，除此之外，LipA 的二、三級結(jié)構(gòu)和催化活性基團均與其他微生物脂肪酶相似。本研究系統(tǒng)地分析了LipA的結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)特性，為后續(xù)LipA 在提高表達量和熱穩(wěn)定性等方面的改造研究提供一定的科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。