降血脂鼠李糖乳桿菌的篩選及其對(duì)高脂模型地鼠血脂的影響

曹藍(lán)，白玉芹，余萍，湯純，矯艷平*，閔祥博

（1.江西仁仁健康產(chǎn)業(yè)有限公司，江西樟樹 331200）

（2.漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司，遼寧沈陽 110000）

血脂是血漿中的膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）等中性脂肪和類脂的總稱，它是生存必須的代謝物質(zhì)。血脂中TC 主要合成細(xì)胞漿膜、類固醇激素及膽汁酸，TG 主要參與體內(nèi)能量代謝[1,2]。隨著社會(huì)的進(jìn)步，生活水平的逐漸提升，食品中營養(yǎng)的不斷增加，飲食中攝入膽固醇食品也在增長(zhǎng)，現(xiàn)如今高血脂癥一躍成為威脅我國中老年人身體健康第一大隱患。關(guān)于高血脂引起的疾病逐漸增多，例如冠心病、心肌梗塞和動(dòng)脈硬化等，此類疾病的發(fā)病率高，治愈率相對(duì)較低，因此需要正確的認(rèn)識(shí)高血脂，并盡早進(jìn)行預(yù)防[3-6]。高血脂癥是指脂肪代謝或者運(yùn)轉(zhuǎn)異常使人體血液中的血脂含量超過正常范圍，其中人體血清中膽固醇過高，甘油三酯過高，高密度脂蛋白膽固醇過低都是高血脂的重要指標(biāo)[7-10]。雖然降血脂的相關(guān)藥物也在不斷的研發(fā)且得到了大量的采用，但是關(guān)于降血脂的藥物或多或少會(huì)具有一定的副作用，而可以輔助降血脂的功能食品則不會(huì)有此影響。

現(xiàn)國內(nèi)外大量的研究人員致力利用益生菌改善血清中的血脂水平，研究結(jié)果表明，一部分益生菌對(duì)于降低血清中的血脂具有顯著的功效[11,12]。在認(rèn)識(shí)了益生菌在對(duì)人體降低血脂有重要作用后，關(guān)于篩選降血脂的益生菌研究逐漸增多，但研究中多數(shù)對(duì)降血脂有作用的菌株都是來自于自然發(fā)酵食物中分離，對(duì)于來源于健康嬰幼兒腸道中的乳酸菌降血脂的試驗(yàn)較少，因此本實(shí)驗(yàn)篩選樣本來自于健康嬰兒的腸道，篩選出的菌株通過體外降膽固醇、甘油三酯試驗(yàn)、膽鹽耐受性試驗(yàn)得出較好的菌株，并進(jìn)行形態(tài)鑒定、過氧化氫試驗(yàn)、16S rDNA 序列分析及電鏡形態(tài)觀察鑒定，以期獲得降血脂性能較好的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)樣品為6 月齡順產(chǎn)健康的嬰兒糞便，確保嬰兒在采樣前沒有服用過任何藥物及乳酸菌產(chǎn)品，采樣工具全部進(jìn)行滅菌處理，并將樣品采集好后套上厭氧袋并使用厭氧產(chǎn)氣包進(jìn)行運(yùn)輸。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

膽固醇（C8667-1G）、牛膽鹽（T4009-5G），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；鄰苯二甲醛（化學(xué)純CP）、硫代乙醇酸鈉（分析純AR），上海麥克林生化科技有限公司；正己烷（分析純AR），天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；葵花籽油，中糧福臨門食品營銷有限公司；甘油三酯試劑盒（A110-1-1），南京建成生物試劑公司。

高膽固醇培養(yǎng)基（MRS-CHOL）：在根據(jù)王湘竹[13]研究所述方法配置MRS 培養(yǎng)基中加入0.3%牛膽鹽，0.2%硫代乙醇酸鈉，100 μg/mL 膽固醇溶液[14]。

甘油三酯培養(yǎng)基[15]：將2%的聚乙烯醇水溶液與植物油按體積比3:1 混合，用超聲波處理（控制參數(shù)每次超聲5 s，間隔時(shí)間5 s，共超聲70 次）后混合均勻制成植物油乳化液作為甘油三酯的來源。將上述制備的植物油乳化液按5%的比例加入到MRS 培養(yǎng)基中，調(diào)pH 至6.5±0.2，在115 ℃下，滅菌30 min，將制備的甘油三酯培養(yǎng)基于4 ℃冰箱冷卻備用。

1.1.3 儀器與設(shè)備

TGL-16M 型低溫高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；SCIENTZ-ⅡD型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司；QL-861 旋渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；LAI-3DT 厭氧手套箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；PHS-25B 數(shù)字酸度計(jì)，上海大普儀器有限公司。

1.1.4 動(dòng)物來源

金黃地鼠（許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001），50只，雄性，90～110 g，購于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離純化篩選及鑒定

將6 月齡順產(chǎn)健康的嬰兒糞便稀釋在平板上分離，37 ℃，48 h 后進(jìn)行觀察，找到典型菌落后，對(duì)其反復(fù)劃線分離及純化后獲得純菌株。通過革蘭氏染色后鏡檢、過氧化氫酶試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，將疑似乳酸菌接種于MRS 斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)并于4 ℃保存?zhèn)溆肹16,17]。

1.2.2 體外降膽固醇及降甘油三酯功能性篩選試驗(yàn)

1.2.2.1 體外降膽固醇功能性篩選（1）乳酸菌的活化

菌株接種5 mL MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃，20±0.5 h，取培養(yǎng)物接種100 mL 上述培養(yǎng)基中，17 h 備用。

（2）膽固醇含量測(cè)定[18,19]

1 mg/mL 膽固醇溶液：用無水乙醇將0.1 g 膽固醇定容于100 mL 容量瓶中，0.22 μm 濾膜過濾除菌，4 ℃儲(chǔ)藏備用。

圖1 是膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=0.0167x+0.0171，R2=0.9953，線性關(guān)系良好。

待用菌種接種于MRS-CHOL 培養(yǎng)基，以未接菌的MRS-CHOL 培養(yǎng)基作為對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)24 h 后離心（6000 ×g，5 ℃，10 min），收集上清液，通過OPA法進(jìn)行測(cè)定。

取上清液4.0 mL，加入2.0 mL 50% KOH，混和均勻后加入3.0 mL 95%乙醇，漩渦震蕩后，將反應(yīng)物置于60 ℃皂化15 min，加入3.0 mL 正己烷，混勻并加入2.0 mL 蒸餾水，漩渦震蕩1 min，靜置15 min。取2.0 mL 正己烷層溶液于干凈離心管中，60 ℃氮吹揮發(fā)，加入2.0 mL 鄰苯二甲醛溶液復(fù)溶，加入1.0 mL濃硫酸，漩渦震蕩，測(cè)定OD550。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品中膽固醇含量

式中：

C0——未接種上清液中膽固醇實(shí)測(cè)濃度，μg/mL；

C——接種后發(fā)酵液上清液中膽固醇實(shí)測(cè)濃度，μg/mL。

1.2.2.2 菌株體外降甘油三酯功能性篩選

（1）乳酸菌的活化

菌株接種于5 mL 培養(yǎng)基中，37 ℃，培養(yǎng)20 h，取5 mL 培養(yǎng)物接至100 mL 培養(yǎng)基中，繼續(xù)以適宜溫度培養(yǎng)17 h，最后將菌液以3%接種量接種至100 mL適宜甘油三酯培養(yǎng)基及未接種菌液的適宜甘油三酯培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，待后續(xù)試驗(yàn)。

（2）單試劑法甘油三酯含量測(cè)定[20]

將培養(yǎng)后的菌液及未接種菌液的適宜甘油三酯培養(yǎng)基分別取10 mL，（6000 ×g，5 ℃，10 min）收集上清液。用96 孔板把樣本、校準(zhǔn)品、蒸餾水取2.5 μL分別加入樣本空、校準(zhǔn)孔和空白孔中，然后再加250 μL 工作液混合，37 ℃孵育，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD510值。

以如下計(jì)算公式計(jì)算未接種乳酸菌的甘油三酯培養(yǎng)基中甘油三酯TG 含量和接種乳酸菌的甘油三酯培養(yǎng)基中殘留TG 含量。

用總TG 含量和殘留TG 含量以如下公式計(jì)算乳酸菌的TG 降解率。

1.2.3 菌株的膽鹽耐受性及耐酸性試驗(yàn)

將傳代三次的菌液按照10%分別接種于空白對(duì)照和不同膽鹽濃度及不同pH 的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃，17 h 培養(yǎng)，進(jìn)行一系列的稀釋，分別取適宜稀釋度的菌液1000 μL 進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)操作，每個(gè)稀釋度2 次重復(fù)，37 ℃靜置培養(yǎng)36～48 h 后測(cè)定活菌數(shù)。

不同條件處理，取樣計(jì)數(shù)測(cè)得的活菌數(shù)（用N 表示）；空白對(duì)照試驗(yàn)中不同時(shí)間取樣測(cè)得的活菌數(shù)（用N0表示）；

1.2.4 降血脂功能菌株的鑒定

通過SH-QO01-004-2019 生物學(xué)檢測(cè)微生物菌種掃描電鏡方法觀察形態(tài)學(xué)特征、16S rDNA 基因序列測(cè)序及BLAST 程序進(jìn)行同源性對(duì)比鑒定篩選出的降膽固醇及甘油三酯能力強(qiáng)且具有較高耐酸耐膽鹽能力的菌株。掃描電鏡檢測(cè)委托中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心完成，16S rDNA 基因序列測(cè)序鑒定委托中國科學(xué)院微生物研究所完成。

1.2.5 體內(nèi)降血脂試驗(yàn)

1.2.5.1 動(dòng)物造模

選取金黃地鼠50 只，平衡飼養(yǎng)3 d 后，按體重隨機(jī)分為5 組，每組10 只，5 組分別為：溶劑對(duì)照組，模型對(duì)照組，樣品的低、中、高劑量組[21]。溶劑對(duì)照組采用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，模型對(duì)照組、鼠李糖乳桿菌HCS01-013劑量組給予高脂飼料喂養(yǎng)7 d造模成功后，HCS01-013（6.5×1010CFU/g）劑量組按照1 g/k..g、2 g/k.g、4 g/k..g 劑量，灌胃喂養(yǎng)28 d，溶劑對(duì)照組與模型對(duì)照組每天灌胃等體積生理鹽水。試驗(yàn)期間，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由攝.食、飲水，同時(shí)，密切觀察動(dòng)物體重生長(zhǎng)情況以及給樣對(duì)動(dòng)物的影響[22]。

1.2.5.2 指標(biāo)檢測(cè)

給樣結(jié)束后，各組試驗(yàn)動(dòng)物禁食12 h，于眼眶后靜脈叢取血，（6000 ×g，5 ℃，10 min）收集上清，應(yīng)用甘油三酯試劑盒測(cè)定各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中甘油三酯含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用軟件SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析，p＜0.05 認(rèn)為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

從嬰兒糞便樣品中篩選分離出6 株純菌株，革蘭氏染色陽性，菌落圓形，乳白色或白色，表面凸起，呈桿狀，接觸酶陰性，初步判斷為乳酸菌[23]。

2.2 體外降膽固醇及降甘油三酯功能性的測(cè)定

2.2.1 體外降膽固醇功能性的測(cè)定

經(jīng)鄰苯二甲醛測(cè)定的6 株乳桿菌膽固醇降解試驗(yàn)（圖2），由圖中可知，各菌株對(duì)膽固醇降解率差異較大，其中3 株菌的體外降膽固醇能力較強(qiáng)，分別為B02-09、D05-08、HCS01-013，降解率分別為49.32%，35.93%，35.40%，其降解機(jī)制可能是通過吸附或共沉淀的方式達(dá)到的，比現(xiàn)有研究如王歡等[24]用鄰苯二甲醛法篩選出的1 株具有降膽固醇功能的植物乳桿菌（降解率為24.95%）及王今雨等[25]用鄰苯二甲醛法篩選出的乳桿菌（膽固醇的降解率32.87%）降解率均高。

2.2.2 體外降甘油三酯功能的測(cè)定

經(jīng)單試劑法（GPO-PAP）甘油三酯含量測(cè)定試驗(yàn)（圖3），由圖可知，各菌株對(duì)甘油三酯的降解率差異較大，菌株B02-09 為19.21%，C03-07 為35.73%、D05-08 為17.64%、E06-11 為13.29%、F08-04 為15.06%，HCS01-013 明顯高于其他菌株（p＜0.05），降解率為44.20%。阿依米熱·毛拉木等用甘油三脂試劑盒測(cè)定含量，篩選出具有降甘油三酯功能的植物乳桿菌[14]，其降解率為39.38%，干酪乳桿菌，降解率為28.43%，盧海鵬用甘油三酯試劑盒篩選出12 株具有降甘油三酯能力的鼠李糖乳桿菌，其中降解率最高的為22.4%[26]。菌株HCS01-013 的甘油三脂降解能力水平較高，可能也是通過吸附或共沉淀的方式降解，有待進(jìn)一步研究，也可進(jìn)一步用于在降血脂保健藥品及功能保健食品的應(yīng)用研究。

2.3 菌株的膽鹽耐受性及耐酸性的測(cè)定

2.3.1 菌株的耐膽鹽能力測(cè)定結(jié)果

正常人體的小腸分泌的膽汁酸濃度一般在0.3%左右，所以菌株需要在高膽鹽環(huán)境下發(fā)揮作用，本實(shí)驗(yàn)選擇4 個(gè)梯度（0.3%、0.5%、1.0%、1.5%）進(jìn)行篩選，結(jié)果如表1。由表1 可見，在0.3%的膽鹽濃度環(huán)境下，6 株菌的存活率達(dá)到95.00%以上，膽鹽濃度提升到1.5%的環(huán)境下，活菌.數(shù)均有下降，僅有2 株菌存活率高于95.00%，其中HCS01-013 的存活率最高為96.79%。

表1 各菌株不同膽鹽濃度中的活菌數(shù)及存活率Table 1 The number of viable bacteria and survival rate in different bile salt concentrations of each strain

2.3.2 菌株的耐酸環(huán)境能力測(cè)定結(jié)果

菌體進(jìn)入到體內(nèi)需要對(duì)相應(yīng)較低酸環(huán)境，人體的胃酸pH 3.5～2.0 左右，所以菌株需要在低酸環(huán)境下發(fā)揮作用，本實(shí)驗(yàn)選擇2 個(gè)梯度（pH 2.0 和pH 3.0）進(jìn)行篩選，結(jié)果如表2。由表2 可見，在pH 3.0 的條件下，6 株菌的存活率達(dá)到85.00%以上，當(dāng)降低到pH 2.0的條件下，活菌.數(shù)均有下降，僅有2 株菌存活率高于50.00%，綜上所述，HCS01-013 對(duì)膽鹽的耐受性及耐酸性較好。

表2 各菌株不同pH 中的活菌數(shù)及存活率Table 2 Number and viable rate in different pH of each strain

表3 菌株HCS01-013 的16S rDNA 序列同源性分析Table 3 16S rDNA sequence homology analysis of strain HCS01-013

2.4 功能菌株鑒定結(jié)果

根據(jù)降膽固醇、降甘油三酯及膽鹽耐受性試驗(yàn)結(jié)果，菌株HCS01-013 具有較強(qiáng)的降血脂能力及膽鹽耐受能力，因此將其作為目標(biāo)菌株進(jìn)行鑒定。電鏡掃描顯示菌株HCS01-013 菌體呈桿狀，0.4～0.5 μm×0.7～1.3 μm，單個(gè)或成對(duì)排列，菌落呈圓形，表面凸起，白色，濕潤且邊緣整齊。結(jié)合BLAST 程序比對(duì)序列同源性分析及16s rDNA 基因序列測(cè)序鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)菌株HCS01-013 的基因序列與鼠李糖乳桿菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）的同源性為100%，在MEGA-X 圖形界面下構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株HCS01-013 在系統(tǒng)發(fā)育樹上Lactobacillus rhamnosusstrain JCM1136 在一個(gè)分支上（圖5），因此鑒定菌株HCS01-013 為一株鼠李糖乳桿菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）。

2.5 HCS01-013 對(duì)高血脂癥地鼠血脂影響

由表4 可知，造模第28 d，模型組與溶劑對(duì)照組相比，血清TG 含量顯著升高，說明在本實(shí)驗(yàn)條件下，高血脂模型造模成功。經(jīng)過28 d 小鼠灌胃處理，低、中、高劑量組血清TG 含量均明顯下降，這說明在此劑量下鼠李糖乳桿菌對(duì)TG 有一定的調(diào)節(jié)能力。

表4 動(dòng)物血清中甘油三酯含量（TG，mmol/L）Table 4 Serum triglyceride content of experimental animals in each group (TG,mmol/L)

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)從健康嬰兒腸道中篩選乳酸菌，并對(duì)膽固醇與甘油三酯的降解率進(jìn)行研究，首先將6 株菌株用鄰苯二甲醛法進(jìn)行膽固醇降解率測(cè)定，其中有3 株菌對(duì)膽固醇降解率高于35%，分別為B02-09，D05-08，HCS01-013。經(jīng)單試劑法（GPO-PAP 法）測(cè)定6 株乳酸菌株的甘油三酯降解能力，結(jié)果菌株HCS01-013 甘油三酯降解能力最強(qiáng)，其降解率為44.20%，在耐酸試驗(yàn)中，菌株HCS01-013 耐酸能力最強(qiáng)，在pH 3.0 和pH 2.0 酸性條件下培養(yǎng)17 h，存活率能達(dá)到88.76%和71.34%。在膽鹽耐受性的實(shí)驗(yàn)中，通過研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過17 h 高濃度膽鹽培養(yǎng)下各菌株的活菌數(shù)和存活率都有所下降，但是各菌株的存活率都能達(dá)到60%以上，均具有較強(qiáng)的耐膽鹽的能力，其中HCS01-013 的膽鹽耐受能力較為突出，在1.5%的膽鹽濃度下存活率達(dá)96.79%。

3.2 盡管本次試驗(yàn)在降低膽固醇、降甘油三酯作用得到實(shí)驗(yàn)支持，但其機(jī)理尚未定論，目前通過實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚩闯鲈诮笛膬身?xiàng)體外試驗(yàn)中HCS01-013 的降解率相對(duì)較好，同時(shí)又具有較強(qiáng)的耐受酸及膽鹽的能力。在對(duì)高血脂癥地鼠試驗(yàn)結(jié)果表明，在高脂飼料的誘導(dǎo)下，血液中TG 含量可明顯升高，經(jīng)過28 d 的鼠李糖乳桿菌HCS01-013 喂養(yǎng)后，金黃地鼠血清TG 含量明顯下降，這說明鼠李糖乳桿菌HCS01-013 表現(xiàn)出了有一定的體內(nèi)降甘油三酯的能力。

3.3 在降膽固醇與降甘油三酯試驗(yàn)過程中所使用的為離心過后的上清液，在之后的實(shí)驗(yàn)中可考慮菌體吸收是否對(duì)試驗(yàn)有影響，并對(duì)其進(jìn)行研究；在HCS01-013對(duì)高血脂癥地鼠血脂影響中發(fā)現(xiàn)各劑量組之間沒有表現(xiàn)出明顯的降甘油三酯量效關(guān)系，這可能與該株菌降解甘油三酯機(jī)理或者給樣時(shí)間較短有關(guān)。由于試驗(yàn)條件所限，本次試驗(yàn)僅對(duì)給樣后金黃地鼠血清中甘油三酯含量進(jìn)行了測(cè)定，之后可增加檢測(cè)如低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等指標(biāo)，考察鼠李糖乳桿菌HCS01-013對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)化的作用，以期更全面的了解該株菌株降血脂的機(jī)理，為后續(xù)的開發(fā)和應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。