高效液相色譜法測(cè)定鹽酸吉西他濱脂質(zhì)體中依地酸鈣鈉的含量

姚玲，顧曉風(fēng)

蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，蘇州 215104

鹽酸吉西他濱（gemcitabine hydrochloride）于1983 年由美國(guó)禮來(lái)公司研發(fā)，我國(guó)于1999 年批準(zhǔn)其制劑進(jìn)口。截至目前我國(guó)現(xiàn)有原料藥和仿制藥批準(zhǔn)文號(hào)總計(jì)44 個(gè)。鹽酸吉西他濱為嘧啶核苷類似物，通過(guò)抑制脫氧核糖核酸（DNA）鏈的延長(zhǎng)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，屬于核苷類抗代謝、抗腫瘤藥物。臨床上，鹽酸吉西他濱給藥方式主要為200mg 靜脈滴注，現(xiàn)已成為治療非小細(xì)胞肺癌以及晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌的首選藥物，具有抗癌譜廣、毒性反應(yīng)小、療效較好等特點(diǎn)［1-2］。鹽酸吉西他濱在體內(nèi)的半衰期短，常見(jiàn)不良反應(yīng)有骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、流感樣反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)、腎毒性等。將鹽酸吉西他濱制成脂質(zhì)體給藥，相比于普通的靜脈滴注給藥方式有更高的血漿曲線下面積（AUC），且由于其半衰期短及具有靶向作用，可以通過(guò)減少給藥劑量來(lái)減少不良反應(yīng)［3-4］。脂質(zhì)體是由一層或多層磷脂雙分子層薄膜包裹的水相組成的微型球狀體。磷脂分子都含有不飽和?；?，金屬離子、光照、pH 等均可影響脂類的自動(dòng)氧化速度，影響脂質(zhì)體的質(zhì)量、穩(wěn)定性和安全性［5-7］。因此，對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行修飾或加入合適的金屬螯合劑、抗氧化劑（維生素E、丁基化羥基甲苯等），可有效抑制其自動(dòng)氧化，提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性［8］。常用的螯合劑有依地酸二鈉和依地酸鈣鈉。依地酸二鈉易與鈣螯合，長(zhǎng)期大劑量使用可引起低鈣血癥［9］。依地酸鈣鈉不與鈣鰲合，可防止該不良反應(yīng)的發(fā)生，但過(guò)量攝入會(huì)增加腎臟損傷、肝功能異常的風(fēng)險(xiǎn)［10］。本文參考相關(guān)文獻(xiàn)［9，11-14］，利用高效液相色譜法，建立了一種測(cè)定鹽酸吉西他濱脂質(zhì)體中金屬螯合劑依地酸鈣鈉含量的方法，并進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，以期為提高鹽酸吉西他濱脂質(zhì)體的制備工藝和質(zhì)量控制提供更多參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

對(duì)照品依地酸鈣鈉（企業(yè)A 提供，批號(hào)SC0005，含量100%）；樣品（企業(yè)A 提供，編號(hào)A1、A2、A3）；陰性樣品（企業(yè)A 提供）；硫酸銅、硫酸銨、聚乙二醇辛基苯基醚等實(shí)驗(yàn)用試藥均為分析純；乙腈為色譜純。

1.2 主要儀器

LC 20AT液相色譜儀、SPD M20A紫外檢測(cè)器、LC solution 色譜工作站［島津（中國(guó)）有限公司］；XS205DU 電子天平、Seven Multi S40 pH 計(jì)（瑞士梅特勒托利多公司）；KB-250DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；KW-1000PC 恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Capcell PAK C18（250mm×4.6mm，5μm）；梯度洗脫，流動(dòng)相A 為0.33%硫酸銨溶液（用稀硫酸調(diào)至pH3.0），流動(dòng)相B 為乙腈，洗脫程序見(jiàn)表1；柱溫35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；流速1.0ml/min；進(jìn)樣量20μl。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 稀釋劑 ［15］

取聚乙二醇辛基苯基醚200ml，加水稀釋至1000ml，于80℃水浴中加熱搖勻，即得。

2.2.2 絡(luò)合劑

取0.5g 硫酸銅，置于100ml 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備

取依地酸鈣鈉對(duì)照品約16mg，精密稱定，置于20ml 量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取1ml，置于50ml 量瓶中，加絡(luò)合劑1ml，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為16.33μg/ml 的對(duì)照品溶液。

2.2.4 樣品溶液的制備

精密量取樣品1ml，置于10ml 量瓶中，加絡(luò)合劑0.2ml，用稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，置于60℃水浴加熱至澄清，作為樣品溶液。

2.2.5 陰性樣品溶液的制備

精密量取不含依地酸鈣鈉的陰性樣品1ml，按照“2.2.4”同法制備，即得。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性考察

分別取稀釋劑、絡(luò)合劑、陰性樣品溶液和對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。稀釋劑、絡(luò)合劑和陰性樣品溶液在依地酸鈣鈉對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間處無(wú)色譜峰檢出，表明稀釋劑、絡(luò)合劑和樣品中除依地酸鈣鈉外的其他成份對(duì)依地酸鈣鈉的測(cè)定均無(wú)干擾。

圖1 HPLC 色譜圖

取樣品1ml 置于10ml 量瓶中，分別加入0.2mol/L 氫氧化鈉溶液、0.2mol/L 鹽酸溶液、30%過(guò)氧化氫溶液1ml，室溫放置4h，酸破壞溶液用0.2mol/L 氫氧化鈉溶液終止破壞，堿破壞溶液用02mol/L 鹽酸溶液終止破壞。另取樣品1ml 置于2個(gè)10ml 量瓶中，分別于4500lx 光照4h、100℃水浴中加熱2h。分別向上述樣品中加入絡(luò)合劑0.2ml，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，置于60℃水浴加熱至澄清，作為酸、堿、氧化、光照、高溫降解樣品溶液。進(jìn)樣后記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明該色譜條件能完全分離依地酸鈣鈉與其他降解雜質(zhì)，方法專屬性良好。

圖2 破壞試驗(yàn)結(jié)果色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.3”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液5ml，置于100ml 量瓶中，加絡(luò)合劑5ml，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻；用稀釋劑逐步稀釋，得到質(zhì)量濃度為0.8、2.0、4.1、8.2、16.3μg/ml 和40.8μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以依地酸鈣鈉的質(zhì)量濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=8965.8219x+413.0544，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，表明依地酸鈣鈉在0.8～40.8μg/ml 濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 定量限與檢測(cè)限

取質(zhì)量濃度為0.8μg/ml 的對(duì)照品溶液，加稀釋劑逐漸稀釋，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。依地酸鈣鈉峰信噪比約為10∶1 時(shí)作為定量限，結(jié)果為0.16μg/ml；信噪比約為3∶1 時(shí)作為檢測(cè)限，結(jié)果為0.05μg/ml。

2.3.4 精密度考察

取對(duì)照品溶液，精密量取20μl 注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，以依地酸鈣鈉峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.11%，結(jié)果表明本方法進(jìn)樣精密度良好，儀器誤差小。見(jiàn)表2。

表2 精密度測(cè)定結(jié)果 n=6

2.3.5 重復(fù)性考察

取同一樣品（A1），按照“2.2.4”項(xiàng)下方法平行制備6 份樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算依地酸鈣鈉在樣品中的質(zhì)量濃度，6 份樣品RSD 為0.28%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果 n=6

2.3.6 穩(wěn)定性考察

取“2.3.5”項(xiàng)下1 份樣品溶液，分別于0、5、10、16h 和24h 進(jìn)樣進(jìn)行分析測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算依地酸鈣鈉的質(zhì)量濃度，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.66%，結(jié)果表明樣品溶液在室溫條件下24h 穩(wěn)定性良好。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性結(jié)果 n=5

2.3.7 回收率試驗(yàn)

精密量取陰性樣品1ml 置于10ml 量瓶中，平行制備9 份，分成高、中、低3 組，分別精密加入“2.2.3”項(xiàng)對(duì)照品儲(chǔ)備液0.16、0.20ml 和0.24ml，加絡(luò)合劑0.2ml，用稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，置于60℃水浴加熱至澄清，制成液含依地酸鈣鈉的質(zhì)量濃度相當(dāng)于處方量的80%（128μg/ml）、100%（160μg/ml）和120%（192μg/ml），按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確性良好。見(jiàn)表5。

2.3.8 耐用性考察

分別考察柱溫變化±5℃，波長(zhǎng)變化±5nm，流速變化±20%，流動(dòng)相變化pH±0.5，同類型不同批次色譜柱對(duì)樣品中依地酸鈣鈉質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果的影響。各變化條件下依地酸鈣鈉峰均能與其他峰基線分離，且各變化條件與“2.1”項(xiàng)下條件所測(cè)結(jié)果基本一致，其RSD 為1.74%，表明該方法耐用性良好。依地酸鈣鈉質(zhì)量濃度的10 次測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 耐用性考察試驗(yàn)結(jié)果 n=10

2.4 樣品測(cè)定

取3 批樣品，每批按“2.2.4”項(xiàng)下方法平行制備2 份樣品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中依地酸鈣鈉的質(zhì)量濃度，結(jié)果分別為160.10、160.35μg/ml 和159.21μg/ml。

3 討論

《中國(guó)藥典》［16］2020 版四部收錄了藥用輔料依地酸鈣鈉，其測(cè)定方法為容量分析法，該方法用于制劑中依地酸鈣鈉含量測(cè)定時(shí)，易受其他成份干擾，專屬性較差。有文獻(xiàn)報(bào)道［9，14］，依地酸鈣鈉的測(cè)定方法主要參考液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、離子色譜法等測(cè)定方法，其中液質(zhì)聯(lián)用法、離子色譜法對(duì)儀器要求較高，與液相色譜法相比，不利于廣泛應(yīng)用。依地酸鈣鈉不含共軛結(jié)構(gòu)，直接測(cè)定需用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器或電導(dǎo)檢測(cè)器，且直接測(cè)定時(shí)，依地酸鈣鈉易與色譜柱不銹鋼表面金屬離子絡(luò)合，導(dǎo)致依地酸鈣鈉響應(yīng)值下降，造成峰形拖尾。選擇適當(dāng)?shù)慕饘匐x子，在柱前對(duì)依地酸鈣鈉衍生化處理，形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，有較強(qiáng)的紫外吸收［9］，選擇紫外檢測(cè)器即可對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，方法靈敏且簡(jiǎn)便。

由于鹽酸吉西他濱與依地酸鈣鈉共同包裹于脂質(zhì)體中，故檢測(cè)時(shí)需破壞其外層脂質(zhì)體，使依地酸鈣鈉釋放出來(lái)。聚乙二醇辛基苯基醚為非離子表面活性劑，以20%聚乙二醇辛基苯基醚溶液（稀釋劑）作為破乳劑，在60℃加熱，即可使脂質(zhì)體完全破壞，使依地酸鈣鈉游離于溶液中［16］。

文獻(xiàn)報(bào)道［10，11-14，17］，高效液相色譜法測(cè)定依地酸鈣鈉含量，其流動(dòng)相pH 常采用pH3.0 和pH7.0 2 個(gè)系統(tǒng)。本研究前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明［14，18］，調(diào)整梯度洗脫程序，2 個(gè)系統(tǒng)均能分離依地酸鈣鈉與其他物質(zhì)，但pH 較大時(shí)，對(duì)色譜柱損傷較大，會(huì)影響色譜柱使用壽命，故本研究中水相的pH 定為3.0。

本研究建立了，測(cè)定鹽酸吉西他濱脂質(zhì)體中依地酸鈣鈉含量的高效液相色譜法，方法操作簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于鹽酸吉西他濱脂質(zhì)體中依地酸鈣鈉含量的監(jiān)測(cè)。