雞眼草中總黃酮的大孔樹脂純化工藝

崔雪靖，王龍光，劉林杰，穆曉燕*

1 漯河醫(yī)學高等?？茖W校第二附屬醫(yī)院藥學部，漯河 462300；2 漯河醫(yī)學高等專科學校，漯河 462002

雞眼草為豆科植物雞眼草Kummerowia striata（Thunb.）Schindl 的干燥全草［1］，臨床主要用于胃腸炎、痢疾、肝炎、夜盲癥、泌尿系統(tǒng)感染等［2］。雞眼草醇提取物中的黃酮類成份能通過調(diào)節(jié)酪氨酸酶活性和黑色素細胞刺激素活性發(fā)揮抑制黑色素生成、抗氧化的作用［3］，且已有研究采用多種技術(shù)分離并確定了雞眼草中的14 種黃酮苷類化合物［4］。雞眼草總黃酮大多采用傳統(tǒng)的乙醇-水溶劑提取法進行提取，除去乙醇后濃縮或真空冷凍干燥，并重新溶解在水中［5］。該方法所得提取物純度不高，仍需進一步純化。大孔樹脂作為一種有機高分子吸附劑，以其吸附解吸能力強、成本低、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化學等領(lǐng)域目標化合物的吸附富集［6］。此外，大孔樹脂可再生重復利用，節(jié)約成本，且不受無機材料中分子的影響［7］。基于此，本研究采用大孔樹脂進一步富集雞眼草黃酮類化合物，并探討其最佳純化工藝。

1 材料

1.1 儀器

R-220 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；752Pro 紫外可見分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）；BSA223S 電子分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；FD5-3 真空冷凍干燥儀（美國西盟國際集團）；SK8210HP 超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；HNY-100B 恒溫培養(yǎng)振蕩器（天津市歐若儀器儀表有限公司）；X1R 臺式高速冷凍離心機（美國 Thermo 公司）。

1.2 試藥

蘆丁對照品（南京景竹生物科技有限公司，批號：20190201，純度≥98%）；D101、NKA-9、HPD400、ADS-17、AB-8、ADS-F8 大孔樹脂均購自天津南開和成科技有限公司；無水碳酸鈉、NaOH、HCl、75%乙醇均為分析純。

實驗用雞眼草采集于貴州省貴陽市花溪區(qū)，經(jīng)漯河醫(yī)學高等專科學校第二附屬醫(yī)院鑒定為豆科雞眼草屬植物雞眼草Kummerowia striata（Thumb.）Schindl 全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 溶液制備

對照品溶液：精密稱定蘆丁標準品31.87mg，用75%乙醇溶解制成濃度為3.187mg/ml 的對照品溶液，4℃冷藏儲存。

供試品溶液：取自然風干的雞眼草研磨粉碎，過40 目篩。精密稱取1g 粉末置于燒瓶中，加入100ml 75%乙醇，80℃回流提取2 次，每次1h。室溫冷卻后，過濾，合并濾液，減壓蒸餾濃縮至無醇味，真空冷凍干燥后用75%甲醇溶解并稀釋至25ml，得到供試品溶液。

2.1.2 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色法確定檢測波長

精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液和供試品溶液各1ml 至10ml 試管中，分別加入75%乙醇至5ml，搖勻，再加入 1ml 5% NaNO2溶液。靜置6min，加入 1ml 10% Al（NO3）3溶液，搖勻，靜置6min，加入3ml 4% NaOH 溶液，搖勻，加入75%乙醇定容。放置15min，以相應的試劑溶液作為空白參比，在200～800nm 波長范圍內(nèi)掃描，記錄光譜圖，見圖1。結(jié)果顯示，對照品和供試品溶液在510nm 處均有最大吸收，因此選擇510nm 為測定波長。

圖1 對照品（A）和供試品（B）的全波長掃描圖

2.1.3 線性關(guān)系

依次精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.0ml，按“2.1.2”項下方法進行配制并測定其在510nm 波長處的吸光度。以濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。結(jié)果表明，蘆丁濃度在0.159～1.593mg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性回歸方程為Y=9.324X-0.0027，r=0.9998。

2.1.4 精密度試驗

精密量取“2.1.1”項下對照品溶液1.5ml，按“2.1.2”項下方法連續(xù)測定6 次，測得吸光度值的相對標準偏差（RSD）為0.30%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復性試驗

取雞眼草樣品1.0g，共6份，精密稱定。按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下方法配制并進行測定，測得雞眼草總黃酮含量的RSD 為0.43%，表明該方法重復性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取“2.1.1”項下供試品試液，分別于0、5、10、15、20、24h 進行測定，測得雞眼草總黃酮含量的RSD 為0.51%，表明供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品9 份，每份0.5g，精密稱定。分別加入對照品溶液適量。按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下方法進行配制并進行測定，計算加樣回收率和RSD。詳見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.2 上樣液制備

取自然風干的雞眼草研磨粉碎，過40 目篩。精密稱取100g 粉末置于燒瓶中，加入100ml 75%乙醇，80℃回流提取2 次，每次1h。室溫冷卻后，過濾，合并濾液，減壓蒸餾濃縮至無醇味，真空冷凍干燥后用蒸餾水復溶，采用溫度為30℃、功率為300W 超聲輔助溶解，并定容至1000ml，即得總黃酮含量為3.33mg/ml 的上樣液，4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 大孔樹脂吸附性能考察

2.3.1 靜態(tài)吸附性能考察

精密量取濃度為1.665mg/ml（C0）的雞眼草總黃酮粗提物50ml（V）于100ml 燒瓶中，加入1g（M）干燥大孔樹脂，密封。采用恒溫培養(yǎng)振蕩器在 25℃、120r/min 條件下振蕩 24h，在6000r/min 下離心10min，取上清液，測定總黃酮含量（C1）。用去離子水完全洗滌樹脂，抽濾至干。轉(zhuǎn)移至100ml 燒瓶中，精密加入70%乙醇50ml，在相同條件下振搖解吸12h，取上清液，測定總黃酮含量（C2）。計算總黃酮的平衡吸附容量（Qe，mg/g）、吸附率（A，%）、解吸附容量（Qd，mg/g）和解吸附率（D，%），公式如下。

由表2 可知，HPD400、D101、ADS-17 和AB-8 型大孔樹脂吸附率較高，而ADS-F8 型大孔樹脂吸附率最低；AB-8 和ADS-17 型大孔樹脂解吸附率較高，其中AB-8 型大孔樹脂解吸附率最高。因此選擇AB-8 型大孔樹脂為最佳純化樹脂，進行后續(xù)實驗。

表2 6 種大孔樹脂的靜態(tài)吸附性能考察結(jié)果 n=3，

表2 6 種大孔樹脂的靜態(tài)吸附性能考察結(jié)果 n=3，

與同項目AB-8 比較，a：P<0.05

2.3.2 動態(tài)吸附性能考察

吸附動力學實驗：精密量取濃度為1.665mg/ml的雞眼草總黃酮的粗提物50ml 置于250ml 帶塞錐形瓶中，加入1g AB-8 型大孔樹脂（吸濾后的濕重）并混合，在25℃下恒溫振蕩處理。每隔30min 取上清液，在 510nm 處測定總黃酮含量，計算吸附率。結(jié)果如圖2 所示，AB-8 型大孔樹脂在0～120min內(nèi)吸附速度較快，在2h 時后逐漸達到平衡。

圖2 AB-8 型大孔樹脂的吸附曲線

解吸附動力學實驗：取“2.3.2”項下吸附飽和的AB-8 型大孔樹脂，用100ml 去離子水洗滌，加入100ml 70%乙醇，在 25℃下恒溫振蕩解吸附，每隔30min取上清液，在510nm處測定總黃酮含量，計算解吸附率。結(jié)果如圖3 所示，AB-8 型大孔樹脂在0～120min 內(nèi)解吸附速度較快，2h 后逐漸達到平衡。

圖3 AB-8 型大孔樹脂的解吸附曲線

2.4 吸附考察

2.4.1 上樣液質(zhì)量濃度對吸附效果的影響

取AB-8 型大孔樹脂15g，濕法裝柱，柱床容積（bed volume，BV）為70ml。取“2.2”項下上樣液，調(diào)節(jié)總黃酮含量分別為3.330、1.625、0.813、0.407、0.204、0.102mg/ml，分別取1BV 加載到層析柱（2.6cm×40cm）柱頂，在25℃下保持 2h以達到吸附平衡。用適量去離子水洗脫至無色，合并洗脫液，在510nm 處測定洗脫液中總黃酮含量，并依據(jù)公式2 計算吸附率，吸附曲線見圖4。由此可知，隨著上樣液質(zhì)量濃度的升高，吸附率呈先升后降的趨勢，在0.813mg/ml 時最高，故選擇該濃度作進一步研究。

圖4 不同上樣液質(zhì)量濃度下的吸附曲線

2.4.2 上樣液體積對吸附效果的影響

取AB-8 型大孔樹脂15g，濕法裝柱。取“2.2”項下上樣液，調(diào)節(jié)總黃酮含量為0.813mg/ml，將其加載到層析柱（2.6cm×40cm）柱頂，流速為0.85BV/h，收集流出液，每份1BV，在 510nm 處測定流出液中總黃酮含量，并依據(jù)公式2 計算吸附率，吸附曲線見圖5。該結(jié)果表明，收集第2 份流出液時，總黃酮開始泄露，第7 份時泄露量劇增，達到0.8mg/ml，達到上樣量十分之一，故上樣體積選擇2BV。

圖5 不同上樣液體積下的吸附曲線

2.4.3 上樣液pH 對吸附效果的影響

取“2.2”項下上樣液，調(diào)節(jié)總黃酮含量為0.813mg/ml，調(diào)節(jié)pH 分別為3、4、5、6、7、8，取2BV 加載到層析柱（2.6cm×40cm）柱頂，在25℃下保持2h 以達到吸附平衡。用適量去離子水洗脫至無色，合并洗脫液，在510nm 處測定洗脫液中總黃酮含量，并依據(jù)公式2 計算吸附率，吸附曲線見圖6。該結(jié)果表明，上樣液pH 為5 時吸附率最高，推測可能因為黃酮是多羥基化合物，呈弱酸性，因此吸附實驗選擇pH 為5 時進行。

圖6 不同上樣液pH 下的吸附曲線

2.5 解吸附考察

2.5.1 乙醇體積分數(shù)對解吸附效果的影響

取“2.2”項下上樣液，調(diào)節(jié)總黃酮含量為0.813mg/ml（C0）、pH 為5，取2BV 加載到層析柱（2.6cm×40cm）柱頂并在25℃下保持2h。達到吸附平衡后，檢測吸附后溶液的濃度（C1）。分別用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 乙醇進行解吸附。流動相的恒定流速為0.85BV/h，洗脫液體積2BV。分別收集洗脫液，50℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，在510nm 處測定洗脫液中總黃酮含量，并依據(jù)公式4 計算解吸附率。由圖7 可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，解吸附率呈先升后降的趨勢，當體積分數(shù)達70%時，解吸附率最高，故選擇乙醇體積分數(shù)為70%。

圖7 不同乙醇體積分數(shù)下的解吸附曲線

2.5.2 洗脫液用量對解吸附效果的影響

采用AB-8 型大孔樹脂在層析柱（2.6cm×40cm）上進行總黃酮的柱色譜純化。取“2.2”項下上樣液，調(diào)節(jié)總黃酮含量為0.813mg/ml、pH 為5，取2BV 加載到柱頂并在25 ℃下保持 2h，達到吸附平衡后，采用70%乙醇洗脫，流速為0.85BV/h，收集洗脫液，每份25ml，在510nm 處測定洗脫液中總黃酮含量，并計算解吸附率。由圖8 可知，當洗脫液體積達到100ml 時，其總黃酮含量最高；當洗脫液體積超過175ml 時，其總黃酮含量低于0.017mg/ml，故選擇洗脫液用量175ml（2.5BV）時可認為總黃酮基本被洗脫完全。

圖8 不同洗脫液用量對總黃酮含量的影響

2.5.3 洗脫速度對解吸附效果的影響

采用AB-8 型大孔樹脂在層析柱（2.6cm×40cm）上進行總黃酮的柱色譜純化。取“2.2”項下上樣液，調(diào)節(jié)總黃酮含量為0.813mg/ml、pH 為5，取2BV加載到柱頂并在25℃下保持2h，達到吸附平衡后，采用70%乙醇洗脫，流速分別為1、2、3、4BV/h，洗脫體積為2BV，收集洗脫液，在510nm 處測定洗脫液中總黃酮含量，并計算解吸附率。由圖9 可知，流速為1BV/h 和2BV/h 時總黃酮解吸率分別達82.13%、81.74%。且隨著流速的增加，總黃酮的洗脫速度降低。因流速低時耗費洗脫液更多、時間更久，因此綜合考慮，選擇2BV/h 作為洗脫速度。

圖9 洗脫流速對解吸附率的影響

2.6 驗證試驗

稱取10kg 樣品，共3 份，稱取AB-8 型大孔樹脂5kg。按“2.2”項下方法制備上樣液，調(diào)節(jié)pH 為5，上樣液體積為2BV，洗脫溶液為70%乙醇，洗脫液用量為2.5BV，洗脫速度為2BV/h。在該條件下進行驗證試驗，測得雞眼草總黃酮含量達77.26%、轉(zhuǎn)移率為88.26%、出膏率為7.57%，表明該工藝穩(wěn)定、純化效果好。結(jié)果見表3。

表3 驗證試驗結(jié)果 n=3，%

3 討論

紫外分光光度法是目前測定總黃酮含量最簡便、高效的方法［8］。本實驗對該測定方法進行了方法學考察，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定可靠，可用于雞眼草中總黃酮的測定。

大孔樹脂的吸附性能與其表面性質(zhì)、孔隙結(jié)構(gòu)和吸附劑的溶解性有關(guān)［9］。本研究探討了6 種大孔樹脂的吸附性能，結(jié)果顯示受試樹脂之間吸附和解吸附率存在顯著差異，表明不同型號的大孔樹脂對雞眼草總黃酮的吸附和解吸附具有選擇性，其中PD400、D101、ADS-17 和AB-8 型大孔樹脂吸附率最高，ADS-F8 型大孔樹脂吸附率最低。另外，AB-8 型大孔樹脂的孔徑可允許黃酮類成份自由進入，NKA-9 型大孔樹脂則不能。因此，除了極性，大孔樹脂的吸附率還可能與其合適的表面結(jié)構(gòu)、高比表面積和合適的孔徑有關(guān)［10］，推測大孔樹脂對總黃酮的吸附可能主要是由于分子篩的多孔網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)和高比表面積，而非吸附劑和總黃酮之間的范德華力或氫鍵作用［11］。對于解吸附，AB-8 和ADS-17型大孔樹脂表現(xiàn)出最高的解吸附效率，這可能是由于其比表面積較大。綜合考慮吸附和解吸附速率，AB-8 型大孔樹脂被選為最佳純化樹脂。本研究在預實驗基礎(chǔ)上，對雞眼草總黃酮純化工藝進行單因素試驗，得到最佳工藝：上樣液pH 為5，體積為2BV，洗脫溶液為70%乙醇，洗脫液用量為2.5BV，洗脫速度為2BV/h。在該條件下進行驗證試驗，結(jié)果顯示雞眼草總黃酮質(zhì)量分數(shù)達到77.26%，表明該工藝穩(wěn)定、純化效果好。

綜上，本研究建立了一種雞眼草中總黃酮大孔樹脂純化工藝。經(jīng)大孔樹脂純化后，總黃酮含量達77.26%。該工藝穩(wěn)定可行、簡便高效，可用于純化雞眼草中總黃酮，同時為進一步研究雞眼草的藥效物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。