反硝化細(xì)菌的分離篩選及反硝化作用影響因素研究

宋玫瀅，孫曉莉，王豆豆，林雅琪 ，劉 洋，2，3

(1.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江湖州 31300；2.浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江湖州 313000；3.新疆第二醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，新疆克拉瑪依 834000)

從1986年到2016年，我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，水產(chǎn)品產(chǎn)量從445萬(wàn)噸猛增加到5 142萬(wàn)噸。然而，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，水體中的殘餌、糞便、水生動(dòng)物尸體、漁藥等物質(zhì)大量增加，造成氮、磷以及其他有機(jī)物大量積累，導(dǎo)致水環(huán)境的污染，生態(tài)環(huán)境日趨惡化。水產(chǎn)動(dòng)物的排泄物、殘餌、尸體中，含有大量的蛋白質(zhì)，被微生物分解后形成氨基酸，再進(jìn)一步分解成氨氮，造成水體富營(yíng)養(yǎng)化，同時(shí)亞硝酸鹽大量積累，嚴(yán)重危害水生動(dòng)物的健康養(yǎng)殖。這些問(wèn)題已經(jīng)成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要因素。如何去除水體中的氨氮和亞硝酸鹽，對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展和水環(huán)境保護(hù)意義重大。

目前發(fā)現(xiàn)的反硝化細(xì)菌分布于10個(gè)不同的科，且屬于假單胞桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬的較多。一直以來(lái)，厭氧反硝化細(xì)菌被認(rèn)為是唯一能夠進(jìn)行反硝化作用的細(xì)菌。直到1983年，ROBERSTON等分離出了在有氧條件下能夠進(jìn)行反硝化作用的細(xì)菌()。NAOKI等研究檢測(cè)到在有氧的環(huán)境下，有兩株細(xì)菌能將硝酸鹽還原，經(jīng)鑒定后，屬于有氧反硝化細(xì)菌。有氧反硝化細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)有特殊意義，對(duì)其后續(xù)的研究也受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。盡管已發(fā)現(xiàn)部分反硝化細(xì)菌，具有較好的反硝化作用，然而，尋找適應(yīng)一些特殊環(huán)境條件的高效反硝化能力的菌株，對(duì)于解決水體富營(yíng)養(yǎng)化和亞硝酸鹽對(duì)水生動(dòng)物的毒害，仍然具有十分重要的理論和實(shí)際研究意義。本研究通過(guò)采集活性污泥樣品，并從中分離反硝化細(xì)菌，研究影響菌株反硝化作用的主要環(huán)境因素，為反硝化細(xì)菌在養(yǎng)殖廢水處理應(yīng)用中提供理論指導(dǎo)，具并有一定實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

用于分離反硝化細(xì)菌的活性污泥樣品分別采自湖州鳳凰污水處理廠、美欣達(dá)印染廠、大港印染廠生化池。

2.2 培養(yǎng)基和試劑

富集培養(yǎng)基Buhospgckud(g/L)：(NH)SO2 g，F(xiàn)eSO0.2 g，KHPO1.0 g，MgSO0.5 g，NaCl2 g，CaCO5 g，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

反硝化細(xì)菌分離培養(yǎng)基：采用Giltay培養(yǎng)基，具體配方詳見參考文獻(xiàn)[16]。

2.2 反硝化細(xì)菌的分離篩選

2.2.1 活性污泥預(yù)處理

將采集的活性污泥樣品1 mL加入到裝有9 mL、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液的100 mL燒杯中，用超聲波發(fā)生器超聲振蕩1 min。

2.2.2 富集培養(yǎng)

將預(yù)處理過(guò)的活性污泥，用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液從10逐級(jí)稀釋至10，取不同稀釋度的樣品液各1 mL，分別接種于含10 mL Buhospgckud培養(yǎng)基的試管中，每一稀釋度重復(fù)接種3管，28 ℃培養(yǎng)20 d(不接種的對(duì)照管同時(shí)培養(yǎng))。每隔3 d取樣0.5 mL進(jìn)行硝化和反硝化定性檢測(cè)和稀釋涂布。

2.2.3 硝化和反硝化細(xì)菌檢測(cè)

用無(wú)菌移液管吸取不同濃度的試管培養(yǎng)液并加入到白色瓷板凹窩中，然后在其中分別加入Griess試劑(Ⅰ液和Ⅱ液各2滴)和二苯胺試劑(2滴)。出現(xiàn)紅色為亞硝化細(xì)菌陽(yáng)性管，出現(xiàn)藍(lán)色為硝化細(xì)菌陽(yáng)性管。在實(shí)驗(yàn)前，需先測(cè)定空白對(duì)照管液體中是否含亞硝酸鹽或者硝酸鹽。

2.2.4 稀釋涂布

將富集后的樣品，涂布在Giltay培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平皿。將涂布好的平板倒置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。觀察菌落周圍是否變藍(lán)，挑取菌落周圍變藍(lán)的菌落進(jìn)行劃線純化。刮取1～2環(huán)菌體細(xì)胞，放入已滅菌的裝有800 μL的15%(v/v)甘油的Giltay液體培養(yǎng)基的菌種保藏管中，并將其放入-80 ℃冰箱進(jìn)行菌株保藏。

2.2.5 產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)

將10 mL Giltay液體培養(yǎng)基加入大試管(20 mm×200 mm)中，將杜氏小試管(5 mm×20 mm)倒立放入大試管中，小試管中的氣體排凈，121℃滅菌20 min后，冷卻至室溫后接入活化后的菌株，30 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，觀察小管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生。

2.2.6 菌株脫氮能力比較

將分離純化的反硝化菌株按1%接種量，接種至100 mL新鮮的Giltay培養(yǎng)基中，30 ℃黑暗條件，靜止(震蕩)培養(yǎng)14 d，每隔2 d取樣1 mL，測(cè)定菌體濃度OD和NO-N，NO-N濃度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。選取脫氮能力最高的菌株進(jìn)行菌種鑒定。

2.3 菌種鑒定

菌株接種于Giltay培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)，進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。利用磁珠法快速提取基因組DNA，具體方法參考文獻(xiàn)[17]。用16S rDNA引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物利用DNA試劑盒純化后，送至上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。對(duì)已測(cè)得的序列提交GenBank進(jìn)行序列比對(duì)，下載與目標(biāo)菌株親緣關(guān)系比較近的菌株的16S rDNA序列。利用Clustal W 1.81進(jìn)行多序列比對(duì)，并用軟件Mega 4.0進(jìn)行分析，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.4 反硝化細(xì)菌脫氮影響因素研究

2.4.1 溫度對(duì)脫氮的影響

將該菌株接種于裝有50 mL滅菌Giltay培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，將培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為4、20、30、37、45 ℃，培養(yǎng)72 h后，測(cè)定菌體OD和樣品中NO-N和NO-N濃度。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以未接菌的培養(yǎng)基做空白對(duì)照。

2.4.2 pH對(duì)脫氮的影響

將培養(yǎng)基初始pH分別設(shè)置為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。菌株接種后，放置于30 ℃培養(yǎng)120 h，分別于培養(yǎng)72 h后取樣，測(cè)定菌體OD和樣品中NO-N和NO-N濃度。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以未接菌的培養(yǎng)基做空白對(duì)照。

2.4.3 溶氧對(duì)脫氮的影響

將該菌株接種于Giltay培養(yǎng)基中，在最適培養(yǎng)溫度30 ℃和pH培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為0、50、100、150、200 r/min，培養(yǎng)72 h后取樣，測(cè)定菌體OD和樣品中NO-N和NO-N濃度。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以未接菌的培養(yǎng)基做空白對(duì)照。

2.4.4 不同C源和硝酸鹽濃度對(duì)脫氮的影響

將該菌株接種于Giltay培養(yǎng)基中，分別添加1%(w/v)的不同種類的碳源(乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉和葡萄糖)和不同濃度的NO-N(0.1，10，100，500，1 000 L)，在最適培養(yǎng)溫度30 ℃、pH和轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)72 h后進(jìn)行取樣，測(cè)定菌體OD和樣品中NO-N和NO-N濃度。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以未接菌的培養(yǎng)基做空白對(duì)照。

2.5 分析方法

菌體濃度的測(cè)定采用移液槍吸取200 μL培養(yǎng)液樣品放入酶標(biāo)板中，再將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，調(diào)整波長(zhǎng)為600 nm，記錄測(cè)量結(jié)果(每個(gè)樣品取3個(gè)重復(fù))。亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[18]，分別采用N-1萘基-乙二胺光度法和紫外分光光度法。

3 結(jié)果與分析

3.1 反硝化細(xì)菌的分離篩選

從活性污泥中分離純化得到44株反硝化細(xì)菌菌株，對(duì)其進(jìn)行脫氮能力檢測(cè)，挑選出四株脫氮能力較強(qiáng)的菌株，分別命名為A、B、G、H，其中菌株A和H脫氮能力最強(qiáng)，分別為67.04%，84.67%。將這四株菌株接種于10 mL Giltay液體培養(yǎng)基上進(jìn)行產(chǎn)氣試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這四株菌株可以在杜氏小管內(nèi)產(chǎn)氣，在管頂部形成明顯氣泡。將這四株菌株保藏用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 菌種鑒定

A、B、G、H四株菌株在含Giltay固體培養(yǎng)基的平板中的菌落形態(tài)見圖1。A菌株為土黃色菌落，菌落較大，表面粗糙，邊緣呈波浪型。B菌株菌落大小中等，呈白色，光滑，中間有凸起，邊緣整齊。G菌株大小中等，圓形，呈藍(lán)色，光滑，中間有凸起。H菌株菌落較小，圓形，白色，光滑，菌落中間有凸起。對(duì)脫氮能力最強(qiáng)的菌株A和H進(jìn)行了16S rDNA擴(kuò)增和測(cè)序，并在GenBank上進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)A菌株與的同源性高達(dá)99.65%(圖2A)，H菌株與的同源性高達(dá)99.72%(圖2B)。因此這兩株菌分別鑒定為A和H。

圖1 反硝化細(xì)菌的分離篩選Fig 1 Screening and isolation of denitrifying bacteria

圖2 反硝化細(xì)菌A菌株(A)和H菌株(B)的遺傳進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree of denitrifying bacteria strain A(A) and strain H(B)

3.3 反硝化細(xì)菌的脫氮影響因素研究

3.3.1 溫度對(duì)脫氮的影響

由圖3可知，A、B、G三株菌株在30 ℃條件下NO-N的濃度最低，表明去除率最高，分別為67.04%、50.14%、33.99%，H菌株在37 ℃條件下，NO-N的濃度最低，表明對(duì)NO-N的去除率最高，為84.67%(圖3B)。A、B、G三株菌株在30 ℃條件下的菌體濃度最高，表明這三株菌株的最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃；H菌株在37 ℃條件下的菌體濃度最高，表明其最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃(圖3A)。

圖3 菌株在不同溫度的生長(zhǎng)情況和對(duì)的去除效果Fig.3 The effects of nitrate removal on different temperatures by the strain

3.3.2 pH對(duì)脫氮的影響

有圖4可知，在pH 6.0的情況下A、B、G、H四株菌株對(duì)培養(yǎng)基中NO-N的濃度最低，表明去除率最高，分別為57.10%，42.21%，33.79%，64.31%(圖4B)，其菌體濃度也最大(圖4A)。菌株的最適培養(yǎng)溫度和最適pH條件下，H菌株的去除率高于其他菌株，為64.31%。

圖4 菌株在不同pH的生長(zhǎng)情況和對(duì)的去除效果Fig.4 The effects of nitrate removal at different pH by the strain

3.3.3 溶氧對(duì)脫氮的影響

由圖5可見，A、B兩株菌株在靜止情況下培養(yǎng)基中NO-N的濃度最低，表明去除率最高，分別為36.17%，33.43%；G菌株在轉(zhuǎn)速為100 r/min的情況下，NO-N的濃度最低，表明去除率最高，為29.23%；H菌株在轉(zhuǎn)速為50 r/min的情況下，NO-的濃度最低，表明去除率最高，為42.91%(圖5B)。菌株A、B在靜止情況下，菌體濃度最高，菌株G在轉(zhuǎn)速為100 r/min條件下，菌體濃度最高(圖5A)。表明A、B兩株菌株需要在厭氧條件下進(jìn)行反硝化作用，G、H兩株菌株可以在有氧條件下脫氮，H菌株在有氧條件下的脫氮能力高于其他三株菌株。

圖5 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株去除效果Fig.5 The effects of rotation speed on nitrate removal

3.3.4 碳源對(duì)脫氮的影響

由圖6可知，A、B、G、H四株菌株均在檸檬酸鈉的環(huán)境下對(duì)培養(yǎng)基中NO-N的濃度最低，表明去除率最高，分別為31.76%、31.49%、24.18%、41.15%，H菌株培養(yǎng)基NO-N濃度最低，表明去除率高于其他菌株(圖6B)。菌株A、H在以檸檬酸鈉和丁二酸鈉為碳源的培養(yǎng)基上，菌體濃度明顯高于其他兩株菌株，在這兩種碳源的培養(yǎng)基上菌體濃度高于其他碳源(圖6A)。

圖6 碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)和去除效果Fig.6 The effects of carbon resources on stain growth and nitrate removal

3.3.5 硝酸鹽濃度對(duì)脫氮的影響：

研究了菌株H在不同硝酸鹽濃度情況下的菌株脫氮情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)基中硝酸鉀的濃度升高，高于1 g/L時(shí)，菌株脫氮速率在提高為71.78%，隨著培養(yǎng)基中硝酸鹽濃度上升，菌株的脫氮能力下降較快。這可能是過(guò)高的硝酸鹽濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)造成毒害，使得其脫氮效率下降(圖7)。

圖7 硝酸鹽濃度對(duì)菌株去除硝酸鹽影響Fig.7 The effects of nitrate concentrations on nitrate removal

4 討論

本研究從污水處理廠的活性污泥中分離篩選得到兩株具有高效反硝化細(xì)菌，其中菌株H為，該屬的微生物菌種被發(fā)現(xiàn)在土壤中廣泛存在，有耐鹽性和生長(zhǎng)pH寬等特點(diǎn)。反硝化作用會(huì)受到環(huán)境因子(溫度、pH、溶氧、碳源和氮源濃度)影響，如何發(fā)揮反硝化細(xì)菌的性能，需要對(duì)反硝化細(xì)菌的反硝化特性進(jìn)行深入研究。

本研究進(jìn)一步研究了環(huán)境因子、C/N源種類和濃度對(duì)于菌株反硝化作用的影響，發(fā)現(xiàn)A、B、G三株菌株在30℃下培養(yǎng)脫氮能力最強(qiáng)，H菌株在37℃下培養(yǎng)脫氮能力最強(qiáng)。溫度對(duì)于菌株脫氮能力有重要影響，這與前人報(bào)道的研究結(jié)果一致。A、B、G、H四株菌株在培養(yǎng)基pH值為6.0的條件下脫氮能力最強(qiáng)，pH高于或低于6.0都會(huì)顯著影響菌體生長(zhǎng)和菌株對(duì)硝酸鹽的利用。pH對(duì)于菌株的反硝化作用有重要影響。大多數(shù)反硝化作用發(fā)生在厭氧環(huán)境中，有少部分細(xì)菌可以在有氧條件下進(jìn)行反硝化作用。本研究發(fā)現(xiàn)反硝化細(xì)菌G菌株和H菌株分別在轉(zhuǎn)速為100 r/min和50 r/min的條件下脫氮能力最強(qiáng)，屬于好氧反硝化細(xì)菌。菌株A和B在靜止條件下，反硝化能力較強(qiáng)。反硝化細(xì)菌脫氮能力受到溶氧濃度影響，過(guò)高或者過(guò)低的溶氧濃度影響菌株的脫氮能力。

碳源對(duì)于菌株的脫氮有重要影響，部分反硝化細(xì)菌需要在一定碳源濃度條件下，進(jìn)行反硝化作用，碳源的種類對(duì)于反硝化作用影響明顯。本研究發(fā)現(xiàn)A、B、G、H四株菌株均在以檸檬酸鈉為碳源的環(huán)境下，脫氮能力最強(qiáng)，與周夢(mèng)娟等報(bào)道的結(jié)果一致，也有其他研究報(bào)道以葡萄糖、琥珀酸為碳源時(shí)菌株脫氮能力最強(qiáng)。不同的菌株所需利用碳源種類不同，說(shuō)明碳源能為異養(yǎng)型反硝化細(xì)菌提供生長(zhǎng)所需的能量，以及反硝化過(guò)程中的電子供體，能影響反硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)和脫氮能力。

本研究發(fā)現(xiàn)H菌株在硝酸鹽濃度高于50 g/L的環(huán)境下，脫氮速率下降，菌體生長(zhǎng)緩慢，與李文甫報(bào)道的結(jié)果有些不同。但是本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的硝酸鹽濃度最低為1g/L，而大于500 mg/L，李文甫報(bào)道的菌株在500 mg/L最低硝酸鹽濃度的條件下脫氮能力最強(qiáng)。硝酸鹽濃度也會(huì)影響菌株的反硝化速度，不同反硝化細(xì)菌脫氮能力有差異，適宜的硝酸鹽濃度環(huán)境下脫氮才能取得較好效果。

反硝化細(xì)菌高效的脫氮效率不僅需要反硝化細(xì)菌的活性強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，還要求反硝化細(xì)菌在合適的環(huán)境條件下。本實(shí)驗(yàn)分離篩選獲得的反硝化細(xì)菌與商品化反硝化菌劑相比，反硝化效率略低。商品化的反硝化菌劑其菌種成分一般不是單一菌株，復(fù)合菌劑的反硝化效果可能優(yōu)于單一菌種。由于課題研究時(shí)間所限，本研究分離篩選到的反硝化細(xì)菌應(yīng)用于實(shí)際養(yǎng)殖廢水的凈化處理還在進(jìn)行之中。另外，關(guān)于H 菌種的反硝化代謝途徑研究還需進(jìn)一步深入研究。

感謝張榮飛老師對(duì)本課題研究提供儀器培訓(xùn)方面的資助。感謝參與課題研究的朱佳娜同學(xué)。