一株大鯢虹彩病毒的分離及鑒定

喻大鵬，程 俊，夏洪麗，夏立群，蔡 佳，魯義善

(1 廣東海洋大學深圳研究院,深圳,518108;2 廣東海洋大學 水產(chǎn)學院,廣東湛江,524088;3 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室,廣東湛江,524088;4 廣東省水生動物健康評估工程技術研究中心,深圳,518018;5 武漢臨空港經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展投資集團有限公司,武漢,430040;6 武漢晟豐農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,武漢,430040)

大鯢()，又名娃娃魚，肉食性，常棲息于巖洞，灘口洞穴內(nèi)，廣泛分布于我國河北、河南、安徽、江蘇、浙江、廣東等地。由于其具有極高的藥用、食用和營養(yǎng)價值，1980年前后在我國廣東及東南亞地區(qū)興起大鯢食用之風，在巨大利益驅(qū)使之下，出現(xiàn)大量盜捕和非法販賣大鯢行為，導致野生大鯢數(shù)量急劇下降。為保護野生大鯢種群數(shù)量，在 21世紀初期，國家大力發(fā)展大鯢人工繁殖馴化。而隨著人工養(yǎng)殖大鯢產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴大及水環(huán)境惡化等問題突顯，導致病原傳播加劇，給大鯢人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。目前研究表明，引起大鯢病害的病原主要包括細菌[腐敗希瓦氏菌()和嗜水氣單胞菌()]、真菌[絲囊霉屬()]、病毒[大鯢虹彩病毒(iridovirus)]和寄生蟲[大鯢卷尾線蟲新種(sp.nov)]。

大鯢虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)，又稱大鯢蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV),屬于虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒屬()，大鯢虹彩病毒病是一種傳播速度快，不易控制，死亡率高且難以防范的病毒病，對全世界大鯢養(yǎng)殖業(yè)均造成非常嚴重的影響。蛙病毒首次由GRANOFF等于 1966 年分離鑒定，其感染范圍非常廣泛，現(xiàn)今已有五十多個變溫脊椎動物家族的上百種動物被蛙病毒感染致死的相關報道。而我國最早發(fā)現(xiàn)CGSIV是在2009 年的甘肅隴南與陜西漢中，患病大鯢死亡率高達90%以上。虹彩病毒感染大鯢初期，行動緩慢，無食欲，體表出現(xiàn)大量黏液；后期下頜出血，身體四肢皮膚潰爛發(fā)炎，肌肉壞死，嚴重者肢體斷裂；解剖可見其體內(nèi)肝臟、脾臟及頭腎等免疫器官腫脹，肺部充血并存在大量出血點，腹腔及腸道內(nèi)充滿黃色液體。

本研究從廣州某野生動物保護基地采集了患病死亡的大鯢樣本，通過體表病患特征及內(nèi)臟剖檢結(jié)果，推測可能是由病毒引起突發(fā)性死亡。隨后使用細胞系培養(yǎng)、透射電鏡切片及分子生物學分析等方法，分離得到病毒株，確定是由CGSIV引發(fā)的死亡。本研究報道的結(jié)果為后續(xù)針對該病毒防控及免疫相關研究工作提供了參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年5月從廣東廣州某野生動物保護基地采集三尾患病死亡大鯢體表潰瘍處肌肉、脾臟和頭腎等免疫組織，患病大鯢體長約2 m。發(fā)病時，大鯢長期蟄伏于水下，反應遲鈍，食欲廢絕，經(jīng)檢測水體溫度和水質(zhì)無異常。

1.2 細胞系、試劑與主要儀器

FHM細胞均由本實驗室保存，M199(Hyclone)培養(yǎng)基，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS， Gibico)，ExDNA 聚合酶，DL 2000 DNA Marker 均購自TaKaRa 公司，DNA 提取試劑盒購自美國Omega公司；CO細胞培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher公司;普通光學顯微鏡購自美國Leica公司；PCR儀購自德國耶那公司;引物合成及序列測定均由華大基因(廣州)股份有限公司完成。

1.3 病原分離

將患病死亡大鯢在無菌條件下進行解剖，取其肌肉、脾臟、頭腎及肝臟等組織樣品，首先進行鏡檢；隨后將解剖取出的各組織在LB固體平板和BHI固體平板上進行劃線，28 ℃條件下過夜培養(yǎng)；剩余樣品使用已滅菌剪刀剪碎置于研缽中，加入適量無菌PBS，反復加入液氮研磨，研磨破碎數(shù)次后，將該勻漿液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，然后在3000，4 ℃低溫離心30 min，隨后使用10 mL無菌注射器取上清液，經(jīng)0.22 μm一次性無菌濾器過濾至無菌15 mL離心管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

FHM細胞用參考文獻[10]方法對細胞進行復蘇并傳代培養(yǎng)，隨后將狀態(tài)好的細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板上，分為三組，一組正常培養(yǎng)作為空白對照，一組添加50 μL無菌PBS作為陰性對照，一組添加等量過濾上清液為實驗組，每組三個平行，每日置于顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，待實驗組細胞出現(xiàn)80%以上CPE病變時，繼續(xù)按照以上方法盲傳三代，穩(wěn)定能看到細胞CPE病變，隨后將收獲的病毒液于-80 ℃保存。

1.4 病毒滴度測定及細胞敏感性比較

將以上CGSIV病毒懸液按照10倍倍比稀釋，稀釋12個梯度備用；參考江育林等的方法進行病毒滴度(TCID)測定，計算CGSIV在細胞系中感染的滴度。

1.5 電鏡樣品制備

將1.3中盲傳兩代的病毒懸液接種于鋪滿FHM細胞的 T25 細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞出現(xiàn)明顯CPE后，收集細胞培養(yǎng)物，室溫下1 000離心30 min，去除細胞培養(yǎng)液，收集細胞沉淀，并將其轉(zhuǎn)移至細胞固定液中，4 ℃避光保存24 h，樣品送由賽維爾公司進行切片處理，置于透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 分子克隆鑒定

將患病死亡大鯢的肝臟、脾臟、頭腎及肌肉組織的總DNA使用 Omega DNA 提取試劑盒進行提取。參考文獻[11]中GSIV病毒主要衣殼蛋白(MCP)基因高度保守序列設計引物，引物如下：GSIV-F:5′-GACTTGGCCACTTATGAC-3′；GSIV-R：5′-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3′。參考江育林等PCR反應體系及反應條件，以上述提取的總DNA為模板，擴增MCP保守序列，擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后送由華大基因(廣州)股份有限公司進行測序。

1.7 PCR擴增產(chǎn)物序列分析

將測序得到的序列在BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.g2ov/Blast.cgi)上進行比對分析,然后選取 GenBank 中與測得序列相似的參考毒株MCP序列，采用分子生物學分析軟件clustl X,和Mega 6.07構建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病大鯢主要癥狀

患病大鯢初期出現(xiàn)食欲廢絕，行動緩慢，長時間伏于水底，皮膚大量分泌粘液；感染后期，患病大鯢出現(xiàn)腹部腫脹(圖1)，下頜和四肢充血(圖1 A)，背部出現(xiàn)大量出血點(圖1 B)，口腔潰瘍。隨著感染加劇，體表及四肢出血點增多擴大，開始潰爛，出現(xiàn)潰瘍；解刨可見其體內(nèi)肝臟、脾臟、腎等免疫器官腫脹(圖1 C)，肺部充血并存在大量出血點，腹腔及腸道內(nèi)充滿黃色液體。發(fā)病一周內(nèi)，患病大鯢相繼死亡。

圖1 CGSIV 感染大鯢的臨床表現(xiàn)與剖解變化Fig.1 Clinical signs and anatomy changes of Chinese giant salamanders infected with CGSIVA；患病大鯢；B患病大鯢體表；C患病大鯢腹腔

2.2 分離病毒引起細胞病變

患病大鯢肌肉、脾臟、頭腎及肝臟鏡檢無異常。從患典型癥狀的患病大鯢病灶組織取樣,于LB固體平板和BHI固體平板上分別過夜培養(yǎng)后,均未分離到細菌，本次患病死亡大鯢癥狀與虹彩病毒感染引發(fā)的癥狀相同，而該病毒又能引起FHM細胞出現(xiàn)典型CPE病變(圖2I)，故采用該細胞系進行回復感染實驗，同時分離該病毒。病鯢組織經(jīng)液氮研磨過濾除菌后，感染本實驗室保存的細胞系FHM。盲傳第一代時，F(xiàn)HM細胞經(jīng)感染后，出現(xiàn)腫脹和破裂，仍有大量細胞貼壁；但盲傳幾代后，F(xiàn)HM細胞出現(xiàn)腫脹和破裂時間變短，大量細胞脫落。結(jié)果表明，F(xiàn)HM是CGSIV的敏感細胞系，多次感染使得CGSIV的毒性加強，感染FHM時間加快。

圖2 CGSIV 感染FHM細胞后的細胞病變效應Fig.2 Cytopathic effect in FHM cells infected with CGSIV

2.3 大鯢虹彩病毒在FHM細胞中的滴度及病毒粒子形態(tài)

根據(jù)TCID計算CGSIV在FHM細胞中的滴度，結(jié)果表明CGSIV在FHM細胞中的滴度為10TCID/mL 。經(jīng)透射電鏡觀察被感染細胞，可見細胞內(nèi)存在大量直徑約100～120 nm、具有囊膜的正六邊形病毒顆粒(圖 3)。

圖3 GSIV 感染 FHM 細胞的超薄切片電鏡觀察Fig.3 Electron microscopy observation of CGSIV in infected FHM cellsA,B,C：透射電鏡下同一視野下不同放大倍數(shù)病毒顆粒

2.4 MCP基因鑒定與序列分析

從患病死亡大鯢肌肉、脾臟、頭腎及肝臟等組織樣品基因組DNA中均擴增到預期大小431 bp的DNA片段(圖4)；測序后進行多序列比對分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該DNA序列和NCBI上蛙病毒屬病毒大鯢虹彩病毒(基因登錄號：ALL53143)的MCP蛋白編碼基因高度同源，高達99%(圖5)；結(jié)合病毒形態(tài)特征與PCR鑒定結(jié)果，確定引起本次大鯢突發(fā)性死亡的病毒為大鯢虹彩病毒。

圖4 CGSIV MCP 基因的 PCR 擴增結(jié)果Fig.4 PCR amplified products of the CGSIV MCP geneM：Marker；1：陰性對照；2：肌肉；3：脾臟；4：腎臟；5：肝臟

圖5 根據(jù)CGSIV MCP基因序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on CGSIV MCP gene sequence of isolated virus.“▲”：分離病毒CGSIV-GZ

3 討論

虹彩病毒是一類具有廣譜感染性的DNA病毒，既能感染脊椎動物，又能感染無脊椎動物，可感染宿主高達上百種。虹彩病毒病流行范圍廣泛，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的病毒性疾病。近些年來，我國已有虹彩病毒感染牛蛙()、鱉()、大鯢()、大菱鲆()、鱖()、牙鲆()、石首魚()和大口黑鱸()等引發(fā)死亡的報道。根據(jù)第十次國際病毒分類委員(International Committee on Taxonomy of Viruses， ICTV)會決定，將虹彩病毒科分為：腫大細胞病毒屬()、綠虹彩病毒屬()、虹彩病毒屬()、淋巴囊腫病毒屬()和蛙病毒屬()五個病毒屬。虹彩病毒科的病毒結(jié)構相似，在透射電鏡下觀察呈六角形，二十面體對稱結(jié)構，病毒粒子通常為120～200 nm，最大直徑可達350 nm。該科病毒不耐高溫，不耐強酸強堿；同時其囊膜極易被有機溶劑和胰蛋白酶破壞，感染能力大大降低。本研究從患病大鯢病灶處取樣，經(jīng)液氮反復充分研磨，可使病毒從細胞中釋放，且低溫不會使病毒失活，可以繼續(xù)感染細胞，隨后將被感染細胞由透射電鏡拍照，發(fā)現(xiàn)其非常符合虹彩病毒科形態(tài)特征結(jié)構，初步判斷引起本次大鯢死亡的病因可能是被虹彩病毒科病毒感染。

由于不動桿菌屬()和氣單胞菌屬()等菌屬感染大鯢引起的病變與CGSIV感染的表型特征相似，同時有可能出現(xiàn)細菌與病毒混合感染的情況，因此患病大鯢臨床解剖結(jié)果只可作為初步判斷依據(jù)，尚需進一步鑒定。本研究根據(jù)CGSIV的MCP蛋白序列高度保守區(qū)一對引物，從病鯢病灶脾臟和腎臟組織中擴增出大約431 bp片段，經(jīng)公司測序及序列比對，發(fā)現(xiàn)該病毒屬于虹彩病毒科蛙病毒屬病毒。由此可見，引發(fā)本次野生大鯢突發(fā)性死亡的病因是虹彩病毒科蛙病毒感染所致。本研究所用檢測方法為常規(guī)PCR檢測，用時較長，同時需要專業(yè)人員在實驗室進行操作。現(xiàn)如今隨著分子生物學技術和病毒分子生物學鑒定技術的發(fā)展，越來越多的新技術應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害檢測中。實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)技術和環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術已經(jīng)用于檢測CGSIV，相比于普通PCR檢測耗時短，操作簡單，更適合早期診斷。

本研究報道的患病大鯢初期出現(xiàn)的癥狀和后期病變均與國內(nèi)外報道的CGSIV感染癥狀相似。以往報道對大鯢以上病變，歸類與是細菌感染引發(fā)，通常都是以細菌做為主要病因來分析，并未進行病毒分離檢測，因此出現(xiàn)此類癥狀，均被認為是條件致病菌感染所致。在本次病發(fā)過程中，基層工作人員在此前從(未死亡)病鯢病灶部位分離到條件致病菌，做完藥敏試驗后，根據(jù)藥敏結(jié)果給病鯢體表涂抹或口服抗菌藥物均無任何效果。外國學者DEBRA等在牛蛙()與林蛙()的研究中，同樣出現(xiàn)此種情況，他們認為是由于CGSIV感染宿主，其免疫器官是病毒感染主要部位，導致宿主免疫力下降，使得宿主菌更易被致病菌感染，當作為細菌病去治療時，并不能達到預期效果。綜合以上結(jié)果，發(fā)現(xiàn)并非本次感染主要病因，引發(fā)本次大鯢突發(fā)性死亡的病因是CGSIV。

研究表明，CGSIV感染發(fā)病速度快，極易擴散，容易發(fā)生繼發(fā)性感染，死亡率高，市面上尚沒有CGSIV治療特效藥。CGSIV結(jié)構復雜，病毒來源和感染宿主廣泛，在養(yǎng)殖過程中需要保證養(yǎng)殖池潔凈、餌料來源安全及按期消毒設施設備，以免病毒擴散。王芳等和余波等發(fā)現(xiàn)患大鯢虹彩病毒病大鯢腹腔注射頭孢拉定和漁用氟苯尼考后，配合Vitamine C+E浸泡具有一定效果。將未患病大鯢連續(xù)一周浸泡黃芪多糖、電解多維和葡萄糖，提高大鯢免疫力，大大降低被感染的概率。同時國外研究學者COUPAR等發(fā)現(xiàn)阿昔洛韋(ACYCLOVIR)對CGSIV感染也具有一定抑制作用。此外，蜂膠、黃芪、菊花、人參、金銀花、芍藥等具有廣譜抗病毒作用的中草藥可以添加到日常餌料中，按時投喂，達到預防作用，但中草藥成分復雜、特異性差、作用機理、劑量、價格和效果不穩(wěn)定，且缺乏數(shù)據(jù)支撐，有待進一步研究。而疫苗具有持續(xù)時間長、針對性強、安全系數(shù)高等優(yōu)點，是目前治療CGSIV感染最佳選擇之一。早在2013年，孫建濱等制備的兩種滅活疫苗對CGSIV感染具有非常好的療效。賈秋紅等通過對病鯢注射自制CGSIV滅活疫苗，治療期間同時注射自制的中西藥結(jié)合的抗病毒藥物，迅速遏制了CGSIV的傳播，使得該養(yǎng)殖場無持續(xù)死亡病例。而曾憲輝等以CGSIV的MCP基因構建核酸疫苗，接種疫苗后的獲得高達73.3%的免疫保護率，表明該疫苗在CGSIV的預防過程中具有潛在的應用價值。