4種花色苷在Caco-2細胞單層模型的轉(zhuǎn)運吸收規(guī)律

蘇 麗， 黨慶玲， 高瑞昌

(1.寧夏賀蘭山東麓葡萄產(chǎn)業(yè)園區(qū)管理委員會，寧夏銀川 753000； 2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

花色苷是自然界中一大類水溶性的植物色素，具有多種對人體有益的健康活性，如改善胰島素抵抗、抗腫瘤、清除體內(nèi)自由基、保護內(nèi)皮細胞等作用。然而，花色苷在體內(nèi)的生物利用度相對較低，其功能特性受到較大限制，因此，闡明花色苷的吸收過程，才能促進其在人體發(fā)揮更大的有益作用。小腸是人體吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要部位，對小腸吸收的研究較多，其中，人結(jié)腸腺癌細胞(Caco-2)最常被使用。Caco-2細胞在體外培育過程中可自發(fā)分化，且在細胞間能緊密地連接成細胞單層，呈微絨毛狀，Caco-2細胞的生化作用與人體小腸極為類似，所以眾多研究人員均將其用作探究小腸吸收的模型。本研究建立Caco-2單層細胞模型，研究Cy-3-G、Dp-3-G、Mv-3-G、Pg-3-G跨膜轉(zhuǎn)運規(guī)律，為評價花色苷的生物利用度提供理論基礎，并為開發(fā)能夠提高不同花色苷生物利用度的轉(zhuǎn)運載體研究提供評價方法和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Cy-3-G、Dp-3-G、Mv-3-G和Pg-3-G(純度≥90%)，購于上海吉至生物化學公司。Caco-2 細胞，購于南京科佰生物科技有限公司。非必需氨基酸、胎牛血清、EDTA-胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、丙酮酸鈉、MEM培養(yǎng)基，購于美國Gibco公司。Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)，購于美國Hyclone公司。25 cm細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板(96孔)、細胞培養(yǎng)板(6孔)、1.5 mL凍存管、Transwell板(膜面積4.67 cm)，購于美國Corning公司；MTT試劑盒，購于碧云天生物有限公司。乙腈、甲醇、甲酸，色譜級，購于美國Sigma公司；檸檬酸等分析級試劑，購于國藥集團化學試劑上海有限公司。

HH-A恒溫水浴攪拌器，購于江蘇中大儀器科技有限公司；Millicell ERS-2 細胞電阻儀，購于美國默克密理博公司；CO培養(yǎng)箱，購于美國Thermo公司；Waters2690高效液相色譜儀，購于美國Water公司；0.22 μm過濾器，購于美國Millipore公司；Multiskan MK3 酶標儀，購于芬蘭Thermo Labsystems公司。

pH值=2.0的檸檬酸溶液：3.84 g/100 mL檸檬酸溶液，微調(diào)pH值至2.0。

1.2 試驗時間和地點

本試驗于2019年在江蘇大學食品與生物工程學院實驗室完成。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜條件 根據(jù)Artursson P的方法：色譜柱：C柱，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動相：A為1%甲酸水溶液，B為1%甲酸乙腈溶液；檢測波長：525 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 液相梯度洗脫程序

1.3.2 標準曲線 稱取1 mg花色苷，采用含10% HCl的甲醇溶液定容至1 mL，配成1 000 μg/mL的儲備液。分別取不同體積上述溶液，采用10% HCl甲醇溶液稀釋，最后得到濃度為10、25、50、75、100和200 μg/mL標準溶液，采用HPLC法，在波長 525 nm 下測定其吸收峰，以濃度和峰面積作標準曲線，橫坐標為濃度，縱坐標為峰面積。

C-3-G標準曲線：=88 5308-15 423，=09 999；

Dp-3-G標準曲線：=29 065+41 918，=09 997；

Pg-3-G標準曲線：=29 038+7 0074，=09 996；

Mv-3-G標準曲線：=31 425+48 572，=09 994。

Cy-3-G、Dp-3-G、Pg-3-G、Mv-3-G濃度與峰面積在10～200 μg/mL線性關系較好。

1.3.3 細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)的方法參考Ying等的方法稍作修改。選擇10～30代Caco-2細胞培養(yǎng)在以MEM為培養(yǎng)基的25 cm培養(yǎng)瓶中，其中，胎牛血清含量為20%、雙抗(青霉素和鏈霉素)含量為1%、非必需氨基酸含量為1%、丙酮酸鈉含量為1%，置于37 ℃，CO含量為5% 培養(yǎng)箱中。每2 d換1次液。當瓶底長滿細胞約80%時，采用 EDTA-胰蛋白酶消化5～10 min，以1 ∶3進行傳代。

1.3.4 Caco-2細胞單層模型的建立 細胞模型建立方法參考Zhao等的方法，并稍作修改。采用PBS把生長良好且處于對數(shù)期的Caco-2細胞清洗2遍，后加入EDTA-胰蛋白酶1 mL左右消化5～10 min后，再加入MEM培養(yǎng)基3～4 mL以終止消化，并反復吹打確保細胞呈單個狀態(tài)。采用血球計數(shù)板在100倍的倒置顯微鏡下直接計數(shù)。加入一定體積MEM培養(yǎng)基配制細胞懸液，細胞濃度達5×10cells/mL，然后接種至6孔Transwell板上。頂側(cè)(AP)加入細胞懸液1.5 mL，基底側(cè)(BL)加入培養(yǎng)基2.5 mL，第2天換液。隨后1周內(nèi)每隔1 d換1次液，從第2個星期起每天換液，培養(yǎng)約21 d時至細胞分化完全。

1.3.5 Caco-2細胞的形態(tài)學觀察 采用倒置顯微鏡直接觀察培養(yǎng)瓶中的Caco-2細胞；接種在Transwell培養(yǎng)板上的Caco-2細胞，在培養(yǎng)14～21 d 后，同樣采用倒置顯微鏡觀察。

1.3.6 Caco-2細胞膜的電阻值測定 電阻值測定參考丁龍的方法并稍作修改。電極在75%乙醇中浸洗15 min，電極晾干后用HBSS清洗。將Tanswell板中AP側(cè)和BL側(cè)的培養(yǎng)基吸去，采用HBSS清洗細胞層1～2遍。隨后向AP側(cè)加入 1.5 mL HBSS，BL側(cè)加入2.5 mL HBSS。電阻值測定時，將電極短端垂直插入培養(yǎng)小室AP側(cè)(不要觸碰到AP側(cè)細胞膜)，長端浸入培養(yǎng)小室BL側(cè)。待示數(shù)穩(wěn)定后，記錄電阻值。計算方法如下：

(Ω·cm)=(-)× 467。

(1)

式中：代表 Caco-2模型的跨膜電阻值，單位為Ω·cm；代表試驗組跨膜電阻，單位為Ω；為空白組電阻，單位為Ω；4.67為6孔Transwell板培養(yǎng)小室的膜面積，單位為cm。

1.3.7 熒光黃通透性 參照祝倩等的試驗方法稍作修改。Caco-2細胞膜培養(yǎng)21 d后使用預加熱至37 ℃的HBSS洗滌3次，然后再放入培養(yǎng)箱中穩(wěn)定30 min。在AP側(cè)加入由HBSS配制的濃度為0.4 mg/mL的熒光黃，在BL側(cè)加入2.5 mL HBSS，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 min。每0.5 h從BL側(cè)取500 μL作為待測樣品進行后續(xù)測定，并用HBSS補充BL側(cè)取樣室溶液。采用酶標儀來測定熒光黃濃度，在492 nm下進行檢測。

熒光黃標準曲線繪制參考毛小琴等的方法。按照下列公式測算熒光黃的滲透率以評價模型的通透性：

(2)

式中：為表觀滲透系數(shù)，cm/s；d/d為單位時間內(nèi)熒光黃的轉(zhuǎn)運量，μg/s；為膜的表面積，cm；為AP側(cè)中熒光黃的初始濃度，mg/mL。

1.3.8 細胞毒性試驗 參照Lakowicz的方法，稍作修改。將100 μL濃度為4×10細胞/mL Caco-2 細胞懸濁液加入到96孔板中，在CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后除去培養(yǎng)液，然后加入系列濃度的花色苷(50～250 μg/mL，HBSS溶解)，再培養(yǎng)24 h。設有空白、陰性和陽性對照試驗組，每組6個復孔。在37 ℃、5% CO條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后除去培養(yǎng)液，采用PBS洗滌1遍后，向每孔加入MTT溶液(50 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用移液器將孔內(nèi)的培養(yǎng)基小心吸除后加入150 μL二甲亞砜，在搖床上使用低速進行振蕩，充分溶解，15 min后，采用酶標儀測各孔的吸光度(550 nm)，細胞的存活率用下列公式進行測算。

(3)

式中：為細胞存活率，%；為試驗組吸光度；為空白組吸光度；為陰性對照組吸光度。

1.3.9 時間對花色苷吸收率的影響 將培養(yǎng)21 d后的Caco-2細胞膜采用預熱的HBSS緩沖液清洗3遍，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min便于除去膜上的雜質(zhì)。除去上層的HBSS，向AP側(cè)加入 200 μg/L 花色苷1.5 mL，向BL側(cè)加入HBSS緩沖液2.5 mL，在 37 ℃、5% CO條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在30、60、90、120、150、180 min從BL側(cè)吸取0.5 mL液體用于檢測，同時向BL側(cè)加入0.5 mL新的HBSS緩沖液補足體積。樣品中加入pH值為2.0的檸檬酸溶液0.5 mL進行酸化處理，采用HPLC進行定量分析。

1.3.10 4種花色苷的吸收率比較 當Caco-2細胞在Transwell上分化成完好且緊實的單細胞層時，采用1.5 mL HBSS從AP側(cè)沖洗Transwell板中的各孔室，向BL側(cè)加入HBSS溶液2.5 mL，清洗3遍，然后在37 ℃、5% CO條件下培養(yǎng)箱中孵育 30 min 便于去除膜上的雜質(zhì)。

4種花色苷濃度為200 μg/mL，從AP側(cè)到BL側(cè)吸收率的測定方法：在AP側(cè)加入1.5 mL花色苷溶液，BL側(cè)加入2.5 mL HBSS，放入CO培養(yǎng)箱中孵育120 min，每0.5 h從BL側(cè)收集0.5 mL的溶液，并用新的等體積HBSS溶液補足，每組設有3個平行。取得的樣品立刻加入pH值為2.0的檸檬酸0.5 mL酸化，然后HPLC測定花色苷的濃度。

花色苷從BL側(cè)到AP側(cè)吸收率的測定方法：在BL側(cè)加入2.5 mL花色苷溶液，AP側(cè)加1.5 mL的HBSS溶液，放入CO培養(yǎng)箱中孵育120 min，每隔30 min從AP側(cè)收集0.5 mL溶液作為樣品，再補入等體積HBSS，每組設3個平行。隨后立即加入pH值為2.0的檸檬酸0.5 mL進行樣品酸化處理，然后利用HPLC測定花色苷的濃度。

轉(zhuǎn)運率計算公式如下：

=(×)/(×)×100%。

(4)

式中：是待測樣品吸收率，%；是BL側(cè)溶液中樣品的峰面積；是BL側(cè)樣品的體積；是AP側(cè)原樣品的峰面積；是AP側(cè)樣品的體積。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

HPLC的數(shù)據(jù)利用Waters 2695自帶軟件處理。所有數(shù)據(jù)處理均利用SPSS16.0進行，每組試驗最少重復3次，結(jié)果呈現(xiàn)為“平均值±標準差”，用檢驗分析比較每組的差異性，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 Caco-2細胞單層的形態(tài)學觀察

在倒置顯微鏡下，Caco-2細胞呈現(xiàn)出不規(guī)則形態(tài)，形狀扁平，放大40倍可見細胞整齊且均勻排列。放大200倍，可見細胞生長勢好、邊緣清晰、結(jié)構(gòu)均一。生長5 d后，能達到80%以上融合，呈“鋪路石”狀緊密排列的單層結(jié)構(gòu)，單個細胞形狀扁平、呈多角形(圖1)。

2.2 Caco-2細胞單層模型的緊密性與完整性

從電阻值的大小可判斷出細胞模型的緊實程度與完整程度。Transwell 6孔培養(yǎng)板中Caco-2細胞模型的電阻值在21 d培養(yǎng)時間內(nèi)不斷增大。電阻在前8 d急速增加，這是由于細胞在這期間快速分裂導致，此時細胞也開始出現(xiàn)小腸上皮細胞的特有結(jié)構(gòu)。16 d開始電阻值增長變慢逐漸平穩(wěn)，表明此時Caco-2細胞單層膜已基本分化完成，在后續(xù)的培養(yǎng)時間里細胞膜越來越密實(圖2)。

細胞的來源、傳代的次數(shù)、培養(yǎng)的條件、實驗操作人員和環(huán)境等均會對Caco-2細胞單層膜的電阻值造成影響，通常情況下電阻參考值在200～1 500 Ω·cm間，本研究中細胞模型的TEER值達到1 058 Ω·cm，說明形成的Caco-2細胞單層模型符合后期轉(zhuǎn)運試驗要求。

2.3 熒光黃通透性

本研究測定的熒光黃標準曲線為=0073 5+0004 7，=0.9 994。按照公式計算得到在0～120 min Caco-2細胞膜的表觀滲透系數(shù)(值)均在(0.26～0.69)×10cm/s間，符合常規(guī)要求的(0.1～0.7)×10cm/s范圍，說明Caco-2細胞培養(yǎng)21 d后，能夠形成完整緊密連接的單層細胞，進一步驗證了所建立的細胞模型滿足后期轉(zhuǎn)運試驗要求。

2.4 細胞毒性

在0～200 μg/mL范圍內(nèi)，4種花色苷對Caco-2細胞活性的影響見圖3。在0～200 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，Mv-3-G無顯著影響(>0.05)。Cy-3-G 濃度為50 μg/mL時，有極顯著的促進作用(<0.01)，但隨著濃度的不斷升高，Cy-3-G對細胞無顯著影響(>0.05)。當濃度等于或低于100 μg/mL時，Pg-3-G和Dp-3-G有顯著促進作用(<0.05)；當濃度為 200 μg/mL 時，2種花色苷對細胞活性無顯著影響(>0.05)。綜上，在0～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，任一濃度都可用于轉(zhuǎn)運試驗。為檢測方便和準確，本研究以200 μg/mL的花色苷進行后續(xù)研究。

2.5 時間對花色苷吸收率的影響

由圖4可知，以Cy-3-G為例，在180 min內(nèi)吸收率逐漸增加，趨于線性?？紤]到在沒有培養(yǎng)基條件下，細胞活性本身就會隨時間減弱，花色苷在37 ℃下會隨著時間延長而發(fā)生降解。為確保吸收研究的可信度，所以將轉(zhuǎn)運時間定為150 min。

2.6 4種花色苷的吸收率

4種花色苷在Caco-2細胞模型中的雙向轉(zhuǎn)運情況見圖5、圖6。由圖5、圖6可知，4種花色苷能以完整的形式被Caco-2細胞迅速吸收。由圖6可知，相同濃度下4種不同苷元結(jié)構(gòu)的花色苷在 Caco-2 細胞層從AP-BL側(cè)的吸收率隨時間延長而增加，吸收率：Mv-3-G>Pg-3-G>Cy-3-G>Dp-3-G。150 min內(nèi)4種花色苷吸收率分別為Mv-3-G(41.01%)、Pg-3-G(38.39%)、Cy-3-G(34.73%)和Dp-3-G(30.93%)。4種花色苷之間吸收差異顯著(<0.05)。由苷元結(jié)構(gòu)分析，羥基數(shù)目越多，花色苷吸收率越低，4種花色苷苷元結(jié)構(gòu)中羥基數(shù)目：Dp(6個)、Cy(5個)、Pg(4個)、Mv(4個)。此外，Dp沒有OCH基團，Mv有2個OCH基團?；ㄉ赵贑aco-2的吸收與它們的分子結(jié)構(gòu)、本身所帶羥基數(shù)量以及分子量等都有較大關系。試驗結(jié)果進一步證明了苷元結(jié)構(gòu)，特別是親水和疏水基團，對花色苷的生物利用度有重要影響。

結(jié)果表明，在150 min內(nèi)，200 μg/mL的Dp-3-G、Cy-3-G、Pg-3-G、 Mv-3-G從AP側(cè)到BL側(cè)和從BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運量均隨著時間的延長而呈線性增長。Dp-3-G、Cy-3-G、Pg-3-G和Mv-3-G從BL側(cè)到AP側(cè)的外排率分別7.81%、7.68%、7.58%和6.04%。Dp-3-G與其他3種花色苷的外排率相比有顯著性差異(<0.05)，Cy-3-G、Pg-3-G和Mv-3-G之間無明顯差異。

對于花色苷吸收機制研究認為，花色苷結(jié)構(gòu)中含有葡萄糖，其腸吸收機制可能與葡萄糖吸收相似，可能共用相同的載體。最新分子模擬研究報道葡萄糖在鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運載體(SGLT1)結(jié)構(gòu)中由羥基與N78、H83、E102、K321、Q457、Y290和W291配位，并通過疏水殘基(L84、F98和F453)和內(nèi)部溶液(部分由Y290)接觸。根據(jù)分子模擬發(fā)現(xiàn)，葡萄糖與人源葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(GLUT1)蛋白分子結(jié)合，結(jié)合能Δ為-6.6 kcal/mol。但花色苷與GLUT1的結(jié)合能低于葡萄糖與GLUT1的結(jié)合能，可能與花色苷B環(huán)上的疏水/親水基團或花色苷的空間位阻有關。Cy-3-G和Dp-3-G分子與SGLT1受體的相互作用比Mv-3-G更強，其原因可能是前2個花色苷中存在大量的羥基，可以與受體周質(zhì)側(cè)的氨基酸產(chǎn)生氫鍵相互作用。半縮酮形式的對接溶液都能通過葡萄糖或B環(huán)結(jié)合到GLUT1的周質(zhì)側(cè)，表明這2個單元在花色苷的入口中均起關鍵作用。氫鍵發(fā)生在花色苷的羥基和glu380、asn317、asn411、asn415、tyr292和thr30殘基的側(cè)鏈之間。已經(jīng)證實了花色苷環(huán)與人腸細胞的GLUT1蛋白(phe379、trp412、trp388、phe72、phe291、his160)周質(zhì)側(cè)的大量芳香殘基之間存在許多疏水作用(-相互作用的疊加效應)。所有這些相互作用強烈地促進了花色苷和人腸細胞的GLUT1之間形成的復合物的高穩(wěn)定性。glu380可通過最短的氫鍵與所有花色苷相互作用，并且在分子對接模擬期間具有很高的占用時間，表明這種殘基在花色苷轉(zhuǎn)運中起著關鍵作用。

2.7 花色苷的表觀滲透系數(shù)

Caco-2細胞模型值越大，其通透率越高。若藥物可以完全吸收，則它的滲透系數(shù)比較大(>1×10cm/s)，如若吸收不完全則滲透系數(shù)較低(<1×10cm/s)。

由表2可知，4種花色苷從AP側(cè)到BL側(cè)的吸收滲透系數(shù)(PAB)均較小，其中，Mv-3-G(8.784×10cm/s)>Pg-3-G(8.221×10cm/s)>Cy-3-G(7.436×10cm/s)>Dp-3-G(6.621×10cm/s)，表明B環(huán)上2個甲氧基的花色苷(Mv-3-G)吸收要大于B環(huán)上2個H的花色苷(Pg-3-G)，且大于B環(huán)上含羥基的花色苷(Cy-3-G、Dp-3-G)。結(jié)構(gòu)上的差異可能會導致花色苷與轉(zhuǎn)運載體間的相互作用發(fā)生變化，導致其轉(zhuǎn)運途徑和速率產(chǎn)生差異。4種花色苷從BL側(cè)到AP側(cè)的滲透系數(shù)即分泌滲透系數(shù)(PBA)大于吸收滲透系數(shù)，外排比(PBA/PAB)依次為Mv-3-G(0.682)、Pg-3-G(0.914)、Cy-3-G(1.024)和 Dp-3-G(1.168)。

表2 4種花色苷的表觀滲透系數(shù)與外排比率

(5)

以上結(jié)果表明，4種花色苷的吸收滲透系數(shù)均不大(<1×10cm/s)，說明吸收轉(zhuǎn)運效率較差，這可能是它們生物利用度不高的原因之一。若組分是經(jīng)過小腸頂側(cè)膜內(nèi)的轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運或外排的，則體現(xiàn)為從BL到AP側(cè)的則會顯著高于從AP到BL側(cè)的。本研究表明，4種花色苷的分泌滲透系數(shù)是吸收滲透系數(shù)的1倍左右，因此顯示這4種花色苷在吸收過程中存在腸道轉(zhuǎn)運蛋白的外排現(xiàn)象，這也可能是導致其生物利用度不高的另一個因素。

根據(jù)PBA/PAB比值與1的大小關系推測出花色苷在小腸吸收中的轉(zhuǎn)運方式。由表2可知，Dp-3-G 和Cy-3-G PBA/PAB均大于1，表明這2種花色苷在Caco-2單層細胞AP側(cè)的轉(zhuǎn)運為主動轉(zhuǎn)運。Pg-3-G和Mv-3-G PBA/PAB小于1，表明二者在Caco-2單層細胞AP側(cè)的轉(zhuǎn)運主要是被動轉(zhuǎn)運。因此，轉(zhuǎn)運方式的不同也可能是導致了其吸收效率存在差異的重要原因。

3 結(jié)論

在200 μg/mL濃度下，4種不同苷元結(jié)構(gòu)的花色苷在Caco-2細胞層模型中從AP-BL側(cè)的吸收率隨時間的增加而增加，吸收率表現(xiàn)為 Mv-3-G>Pg-3-G>Cy-3-G>Dp-3-G。4種花色苷的吸收表觀滲透系數(shù)均不高(<1×10cm/s)，還存在外排現(xiàn)象，雙向轉(zhuǎn)運均對時間有顯著依賴性，且主動和被動運輸共存。Dp-3-G和Cy-3-G這2種花色苷在Caco-2細胞單層AP側(cè)上轉(zhuǎn)運時主要是主動轉(zhuǎn)運機制，而Pg-3-G和Mv-3-G在Caco-2細胞單層AP側(cè)上轉(zhuǎn)運時主要是被動轉(zhuǎn)運機制?；ㄉ誃環(huán)結(jié)構(gòu)中的甲氧基和羥基的差異可能是導致其轉(zhuǎn)運吸收差異的根本原因，但還需進一步研究。另外對于花色苷的腸細胞轉(zhuǎn)運載體還需進一步深入研究。