賴家豪, 熊桂紅, 劉 冰, 蔣軍喜, 游 婧, 劉彤珂
(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)系,江西南昌 330045)
放線菌是一類形體微小多樣、主要呈菌絲狀生長、以孢子進(jìn)行繁殖的原核微生物,其生長形態(tài)多變,呈絲狀、放射狀、星狀分枝,也可形成不規(guī)則形狀的桿狀或球狀,屬于革蘭氏陽性菌。該類菌存在于多種生態(tài)環(huán)境中,憑借其獨特高級的次級代謝系統(tǒng)產(chǎn)生諸多結(jié)構(gòu)新穎、具有明顯生物活性的次級代謝產(chǎn)物,是一類極具價值的微生物資源。放線菌與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為密切,其產(chǎn)生的活性物質(zhì)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、工業(yè)、環(huán)境污染治理等各個方面。在農(nóng)業(yè)方面可作抗菌劑、殺蟲劑以及除草劑等,如井岡霉素、春雷霉素、多氧霉素等已應(yīng)用于植物病害防治中;在醫(yī)藥方面可作為抗腫瘤藥物,治療心血管疾病藥物等,如蒽環(huán)類(阿霉素)、肽類(博來霉素和放線菌素D)等;在食品方面可被應(yīng)用于天然食品添加劑和防腐劑,如藍(lán)色素、類胡蘿卜素等。可見,獲得放線菌的活性物質(zhì)具有廣闊的用途和極高的開發(fā)應(yīng)用價值。然而,活性物質(zhì)的挖掘和分離遠(yuǎn)比想象中復(fù)雜,存在很多難題,如辛苦分離出來的化合物已經(jīng)被報道而失去研究價值,某些代謝物在常規(guī)條件下無法合成,或活性物質(zhì)表達(dá)量太低等。因此,本文綜述近幾十年發(fā)展起來的活性物質(zhì)挖掘和分離方法,以期為挖掘和利用微生物活性物質(zhì)提供試驗思路和方法。
放線菌活性物質(zhì)的挖掘手段豐富多樣,應(yīng)用最早、最傳統(tǒng)的是以生物活性為導(dǎo)向,從放線菌的發(fā)酵液粗提物中分離篩選出天然產(chǎn)物的方法。其中的生物活性范圍廣泛,包括殺蟲殺螨、抑菌、抗癌、抗腫瘤等等,利用這些生物活性對放線菌產(chǎn)生的代謝物質(zhì)進(jìn)行篩選,不僅操作簡單,出結(jié)果快速,而且成本低,要求低,至今仍被廣大研究者用于簡單的放線菌活性物質(zhì)挖掘篩選。到目前為止,利用這種方法,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了諸多天然活性物質(zhì)。路丹丹等以黃瓜枯萎病原菌(f. sp.)作為活性跟蹤指示菌,從M527的發(fā)酵液中分離得到活性化合物——龜裂殺菌素。劉倍伶以對蘋果黃蚜、朱砂葉螨、小菜蛾、黏蟲的毒殺活性,對黏蟲的拒食活性為導(dǎo)向,從11-9-3的發(fā)酵液中篩選出2個對朱砂葉螨具有較好毒殺活性的化合物 1-acetyl-4,5-dihydroxyanthracene-9,10-dione和1,8-dihydroxy-6-methylanthracene-9,10-dione,以及對黏蟲有一定拒食活性的化合物convolvulol。She等以抗菌活性為指導(dǎo),從BCC 24770 的發(fā)酵液中分離出2種新化合物chresdihydrochalcone和chresphenylacetone,其中化合物chresdihydrochalcone對多種革蘭氏陽性耐藥菌具有抑制活性,具有開發(fā)為抗生素的潛力。由此可見,利用該方法篩選活性物質(zhì)不僅簡便,選擇性高,還能獲得理想的結(jié)果,具有一定的可行性和優(yōu)勢,今后將繼續(xù)用于科研試驗中。不過這種傳統(tǒng)篩選方法仍具有一些局限,比如大部分最終獲得的活性物質(zhì)是前人已研究的化合物;發(fā)酵液中活性化合物的含量低導(dǎo)致后續(xù)篩選和分離提純較為困難;部分活性化合物的產(chǎn)生要求給予放線菌一般實驗室很難提供的特殊培養(yǎng)條件等。
為解決傳統(tǒng)活性物質(zhì)挖掘技術(shù)存在的問題,近年來,研究者們不斷鉆研、創(chuàng)新,取得了顯著的進(jìn)展。基因組挖掘技術(shù)就是新發(fā)展起來的一種熱門研究方法。隨著基因組測序技術(shù)的迅速發(fā)展和完善,微生物基因組大規(guī)模測序和分析被普遍和廣泛地應(yīng)用于放線菌活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和利用。放線菌基因組挖掘主要指在對放線菌進(jìn)行全基因組測序的基礎(chǔ)上,利用生信分析網(wǎng)站及軟件對獲得的組裝序列進(jìn)行分析,尋找次級代謝產(chǎn)物合成基因簇的保守序列,進(jìn)行基因預(yù)測及功能注釋,預(yù)測次級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑和化學(xué)結(jié)構(gòu),從而順利分離鑒定目標(biāo)化合物。這種方法使我們對放線菌代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)功能的認(rèn)識更加深刻,相比較傳統(tǒng)篩選方法,能夠更迅速和準(zhǔn)確地尋找到新的或具有活性的化合物,為后續(xù)活性物質(zhì)的分離鑒定提供理論基礎(chǔ)。除此之外,該方法還可能對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行定向改造,使其具有更好的生物活性,這是傳統(tǒng)篩選方法所不具備的?;蚪M挖掘方法豐富多樣,各有千秋,并且往往靈活結(jié)合使用時效果更佳,特別是以下簡要闡述的幾種手段。
1.2.1 生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析起步于20世紀(jì)90年代,發(fā)展至今已經(jīng)比較成熟,是基因組挖掘技術(shù)的重要手段,并成為很多挖掘方法的必要前提和可靠依據(jù)。在對放線菌進(jìn)行全基因組測序后,可以借助相關(guān)軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,主要包括基因組組裝及組分分析、基因預(yù)測與功能注釋、比較基因組分析、群體進(jìn)化和物種分型分析、直系同源簇(cluster of orthologous group,簡稱COG)聚類分析、基因組可視化分析及次級代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測,并且分析預(yù)測生物合成基因簇可能編碼合成新的結(jié)構(gòu)。近年來,許多研究者利用生物信息學(xué)分析技術(shù),準(zhǔn)確地從放線菌中分離到目標(biāo)活性物質(zhì)。如Peng等通過對篩選得到的角環(huán)素潛在生產(chǎn)菌進(jìn)行生物信息學(xué)分析,得到預(yù)測產(chǎn)物為saquayamycins類角環(huán)素,最終從該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液中分離到新化合物landomycin N、galtamycin C、vineomycin D 和saquayamycins B類角環(huán)素化合物,其中saquayamycins B在對肝癌細(xì)胞HepG-2、SMMC-7721和plc-prf-5的抑制作用中顯示出有效的細(xì)胞毒活性。王冕等通過基因組生物信息學(xué)分析,推測海洋鏈霉菌IMB3-202基因組中含有一條吲哚咔唑生物合成基因簇,最終從發(fā)酵產(chǎn)物中分離到對宮頸癌HeLa細(xì)胞和結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞均具有很強的細(xì)胞毒活性的星形孢菌素、3′--去甲基星形孢菌素等吲哚咔唑類化合物。近年來,隨著分子生物學(xué)和信息技術(shù)等多學(xué)科的迅速發(fā)展,生物信息學(xué)分析不斷完善,主要表現(xiàn)在分析工具多樣化,分析技術(shù)全面準(zhǔn)確,利用該手段,能從大量嘈雜的數(shù)據(jù)中提取有用的生物學(xué)信息,是放線菌活性物質(zhì)挖掘研究中至關(guān)重要的法寶。
1.2.2 同源表達(dá) 盡管利用生物信息學(xué)分析獲得了大量的數(shù)據(jù),但事實上,活性物質(zhì)的挖掘仍然不易,經(jīng)常會碰到各種各樣的難題,特別是有些放線菌的生物合成基因簇的表達(dá)量很低,或者甚至不表達(dá)。為此,近年來研究者們開發(fā)了一些手段去誘導(dǎo)這些基因簇表達(dá),從而獲得大量的天然活性產(chǎn)物。這種通過某些手段誘發(fā)機體自身所帶的基因表達(dá)的方法稱為同源表達(dá)。比如,通過優(yōu)化放線菌的培養(yǎng)條件來誘導(dǎo)基因表達(dá)并獲得產(chǎn)物就是常用的方法之一。由于放線菌產(chǎn)生的某些代謝物在常規(guī)條件下無法合成,可以給予一些比較特殊的營養(yǎng)和生物條件甚至是特定的脅迫環(huán)境來激活這些代謝物的合成,如特定的碳源、高溫和其他菌株共培養(yǎng)等。近些年,國內(nèi)外就有許多成功的事例,如Hifnawy等通過共培養(yǎng)sp. UR56和sp. EG49這2種放線菌,誘導(dǎo)產(chǎn)生了具有抗菌和抗生物膜活性的吩嗪-1,6-二羧酸二甲酯、吩嗪-1-羧酸等4種物質(zhì)。此外,通過操縱調(diào)控因子也可以激活生物合成基因的表達(dá)。其中最常用的手段是過表達(dá)正調(diào)控基因,正調(diào)控基因主要指一些轉(zhuǎn)錄、翻譯激活因子等,因此利用這種方法可以有效地獲得新型活性化合物。Du等從sp. MSC090213JE08的SARP-7過表達(dá)突變株中分離得到一個新的多烯類化合物ishigamide。Yan等通過表達(dá)基因,促進(jìn)了十一烷基靈菌紅素和放線紫紅素的合成。Laureti等通過對ATCC23877基因簇上的LAL家族調(diào)控基因進(jìn)行過表達(dá),合成了具有抗結(jié)腸癌HT29細(xì)胞系活性的stambomycins A-D。過表達(dá)轉(zhuǎn)錄、翻譯激活基因取得了如此多成果,已然成為研究者們常用的挖掘手段,除此外敲除某些轉(zhuǎn)錄抑制基因也是有效的挖掘手段,如Bunet等敲除生二素鏈霉菌()中TetR家族途徑特異性轉(zhuǎn)錄抑制基因,可以合成醌那霉素類抗生素。
1.2.3 啟動子替換 放線菌代謝途徑復(fù)雜,操縱調(diào)控因子并不能激活所有的次級代謝基因簇,對于一些隱秘基因簇的激活,可以嘗試使用強組成型或者強誘導(dǎo)型啟動子替換原始啟動子。啟動子是RNA 聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA 序列,多數(shù)位于結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始點的上游,被稱為基因表達(dá)的“開關(guān)”。因此,進(jìn)行啟動子替換往往能夠取得較為可觀的結(jié)果。2020年,孫濤利用gBAS重組系統(tǒng)將唐菖薄伯克霍爾德菌() ATCC 10248中6個未知的NRPS基因簇的原始啟動子替換為慶大霉素抗性基因的強啟動子,成功激活BGC2和BGC5,并獲得了幾種由脂肪酸鏈和氨基酸縮合而成的線性脂肽,均為新化合物。同年,Zheng等通過將巨大副伯克霍爾德菌() DSM 23488中2個隱秘基因簇的啟動子替換為強啟動子,激活了沉默的BGC,成功挖掘到新型脂肽類化合物haereomegapolitanin。
1.2.4 異源表達(dá) 由于放線菌產(chǎn)生活性天然物質(zhì)的過程仍存在許多難題(如有些放線菌生長緩慢,或者很難獲得純培養(yǎng)物,有些微生物操縱調(diào)節(jié)因子較難進(jìn)行等),因此將其生物合成基因簇克隆并在合適的宿主中異源表達(dá)成為一種有效且備受關(guān)注的天然產(chǎn)物挖掘策略。異源表達(dá)是指通過基因工程,將生物合成基因簇中的多個基因或整個基因簇放到異源宿主中進(jìn)行表達(dá),從而獲得特定天然產(chǎn)物。目前放線菌基因簇異源表達(dá)常用的宿主菌為大腸桿菌()、鏈霉菌()和枯草芽孢桿菌()等。隨著生物技術(shù)日新月異的發(fā)展,異源表達(dá)可操作性逐漸提高,且挖掘到新型天然活性產(chǎn)物的概率較大,因此受到了越來越廣泛的關(guān)注。Antosch等將sp.T6239 的基因簇ika在體外進(jìn)行重排,然后將結(jié)構(gòu)基因置于誘導(dǎo)型啟動子T7的控制下,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中異源表達(dá),分離得到具有成藥前景的ikarugamycin。2018年,Yu等構(gòu)建了包含完整ST基因簇的質(zhì)粒pDRX-27,并轉(zhuǎn)入到M1146中異源表達(dá),獲得了一種具有生物活性的抗生素——streptothricin。 Shi等利用生物信息學(xué)分析,從NA4264中鑒定出能夠合成環(huán)二肽合酶的基因簇,但該基因簇在常規(guī)培養(yǎng)條件下不表達(dá),于是將其在中異源表達(dá),產(chǎn)生了一種新的高度修飾的環(huán)二肽——purincyclamide。盡管從目前研究的進(jìn)展來看,異源表達(dá)的方法能夠有效地分離到目標(biāo)代謝產(chǎn)物,提高活性物質(zhì)的產(chǎn)量,但該方法仍存在許多挑戰(zhàn),比如一般生物合成基因簇都比較大,表達(dá)克隆載體構(gòu)建及基因表達(dá)難度較高,需要導(dǎo)入化合物生物合成的前體來解決異源宿主缺乏這些前體的問題,未來仍然需要花費大量工作去攻克這些問題,使得天然活性物質(zhì)的挖掘更加簡單快速。
1.2.5 代謝比較分析 由于放線菌產(chǎn)生的大部分活性物質(zhì)都屬于其次級代謝產(chǎn)物,因此對其發(fā)酵代謝產(chǎn)物的研究是至關(guān)重要的,特別是目前可借助現(xiàn)代分子生物學(xué)手段使得從代謝產(chǎn)物中挖掘到活性物質(zhì)變得更簡單明確。代謝比較分析法是指先對放線菌生物合成基因簇中的關(guān)鍵基因進(jìn)行敲除或是異源表達(dá)來構(gòu)建突變株,再尋找野生型和突變株的代謝產(chǎn)物譜圖的差異,并結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測的產(chǎn)物理化性質(zhì)來直觀地發(fā)現(xiàn)對應(yīng)的代謝產(chǎn)物。將基因簇中的關(guān)鍵基因失活,再通過比較野生型和突變株的代謝譜圖(HPLC或LC-MS)來尋找差異,最終能夠分離鑒定出基因簇對應(yīng)的產(chǎn)物。如Lee等利用這種方法從sp. W3002中分離到2種新的鏈米酮衍生物。王俊博等通過構(gòu)建目標(biāo)基因簇大片段缺失突變株,并同野生型菌株比較代謝譜圖發(fā)現(xiàn)了制霉菌素。對于異源表達(dá)生物合成基因簇,可比較野生型宿主和異源宿主的代謝譜圖(LC-MS),新出現(xiàn)的代謝物一般即為基因簇產(chǎn)物,再進(jìn)一步分離鑒定。如Corre等通過構(gòu)建基因的整合質(zhì)粒pIJ6566,并將其整合到天藍(lán)色鏈霉() M512中進(jìn)行異源表達(dá),經(jīng)過代謝譜圖比較后發(fā)現(xiàn)了第1個自體誘導(dǎo)物methylenomycin,其能調(diào)控鏈霉菌中抗生素的產(chǎn)生。
廣義的轉(zhuǎn)錄組指某一特定生理條件下,細(xì)胞內(nèi)全部基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的總和,包括轉(zhuǎn)運RNA、核糖體RNA、信使RNA以及各種非編碼RNA,狹義的轉(zhuǎn)錄組指細(xì)胞內(nèi)全部mRNA的總和。與基因組不同的是,轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時間和空間的限定。轉(zhuǎn)錄組挖掘技術(shù)是指通過對某一狀態(tài)(如不同培養(yǎng)基或某個時間點培養(yǎng))的放線菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及分析,得到放線菌基因簇的轉(zhuǎn)錄情況,反映放線菌應(yīng)對不同環(huán)境刺激后,其應(yīng)對基因的動態(tài)表達(dá)狀況,從而挖掘功能基因或基因簇。該技術(shù)能為發(fā)現(xiàn)化合物提供更直接的信息,并且有助于發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)錄活性的與未知天然產(chǎn)物相關(guān)的生物合成途徑,在放線菌次級代謝產(chǎn)物的生物合成機制和挖掘研究領(lǐng)域呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。Han等借助轉(zhuǎn)錄組分析,從YIM 90087T 中分離得到能夠調(diào)節(jié)滲透壓平衡的四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶。Amos等利用這種方法,對不同環(huán)境條件下的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,并且對高表達(dá)的生物合成基因簇進(jìn)行生物信息學(xué)分析,成功預(yù)測并分離得到一種新型salinipostins。Qu等在不同條件下對鏈霉菌() DSM 9954進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),最終選用產(chǎn)生代謝產(chǎn)物最多的使用V培養(yǎng)基發(fā)酵4 d的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,最終發(fā)現(xiàn)了化合物sanglifehrin的生物合成基因,并且發(fā)現(xiàn)了新的聚酮合酶和非核糖體多肽基因。相比較于基因組挖掘技術(shù),轉(zhuǎn)錄組挖掘從RNA層次研究生物合成基因及基因簇表達(dá)情況,提供不同條件下各個基因的表達(dá)情況,從而獲得更高效的有用信息,在放線菌活性物質(zhì)挖掘手段中占據(jù)重要地位,相信未來利用該技術(shù)將會挖掘出大量具有巨大應(yīng)用價值的活性物質(zhì)。
溶媒萃取法最早應(yīng)用于19世紀(jì)分析化學(xué)領(lǐng)域,并且在1925年因二苯基硫卡巴腙的發(fā)現(xiàn)而獲得了迅速的發(fā)展,如今應(yīng)用于多個領(lǐng)域,在放線菌的活性物質(zhì)分離方面取得了不少研究成果。該方法巧妙利用化合物在2種不相溶或者微溶的溶劑中的溶解度或者分配系數(shù)不同的原理,使得待萃取的化合物轉(zhuǎn)移到溶解度更大的溶劑中,并經(jīng)過多次反復(fù)萃取,將化合物分離出來。比較常見的萃取溶劑有:水、親水性有機溶劑(乙醇、甲醇、丙酮等)、親脂性有機溶劑(石油醚、苯、三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯等)。這種方法是活性物質(zhì)挖掘過程中最為常用的分離提取方法之一,具有簡單方便、成本低、對環(huán)境友好等優(yōu)點,廣大研究者利用該方法獲得了理想的活性物質(zhì)。Cho等借助這種方法用乙酸乙酯萃取sp. CS392發(fā)酵液中的活性物質(zhì),最終分離得到3種對多種革蘭氏陽性耐藥菌具有很高活性的化合物。Driche等通過用二氯甲烷從sp. AT37的發(fā)酵液中提取到一種對耐多藥金黃色葡萄球菌具有顯著活性的化合物(AT37-1)。盡管該方法具備眾多優(yōu)點,但仍存在一些短板,如分離出的物質(zhì)僅為粗提物,純度不夠高,由此可見結(jié)合其他分離技術(shù)來獲得純物質(zhì)是必不可少的。
隨著生物化學(xué)研究的不斷發(fā)展,離子交換層析被廣泛用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、核酸、酶類、糖類、脂類等的分離純化。與其他層析法不同,離子交換層析法的固定相為離子交換劑,常用的如離子交換纖維素、離子交換樹脂等,憑借流動相中的組分離子與固定相上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小差異,使得目標(biāo)化合物從混合物中分離出來。近年來,研究者們熱衷于利用該方法分離放線菌次級代謝產(chǎn)物中的水溶性生物活性物質(zhì)。2016年,Savitha等利用該方法從篩選到的鏈霉菌菌株中分離得到可用于治療淋巴細(xì)胞性白血病的-谷氨酰胺酶。2019年,Dhamodharan等利用離子交換層析法從VITSD8中分離得到對溶栓性疾病有藥用潛力的纖溶酶粗品。這種方法特異性較高,分離效果好,并且樹脂等離子交換劑也便宜,不過即便是用最精確控制的條件,僅用此方法分離到的物質(zhì)也不是特別純。
薄層層析別稱薄層色譜(thin layer chromatography,簡稱TLC),屬于固-液吸附色譜法,同時具有柱色譜和紙色譜的優(yōu)點。其利用待分離物中各組分對吸附劑吸附能力的差別,借助展開劑的作用使得各組分在薄層板上獲得不同的移動速度從而分離開來,并且還能通過計算比移值()來進(jìn)行定性分析等。薄層層析法容易操作,儀器簡易,顯色迅速,同時混合物分離效率高,耗時短,普遍應(yīng)用于混合物的分離、定性及定量分析。近年來,技術(shù)人員對薄層色譜法在縮短時間周期、優(yōu)化分離效果、提升檢測質(zhì)量及靈敏性、保證定量精度及降低生產(chǎn)成本等方面進(jìn)行不懈研究,取得較大突破。在該方法不斷完善進(jìn)步的同時,其在放線菌活性物質(zhì)分離方面的應(yīng)用也逐漸普遍。就在2021年2月,Kamaruddin等利用這種方法從海洋放線菌中篩選分離出可作為阿爾茨海默氏癥患者的最佳治療劑的乙酰膽堿酯酶抑制劑(AchEIs)。Saadouli等利用乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析、薄層色譜結(jié)合的方法,從V16R3Y1中分離提純出具有廣譜抗菌活性的環(huán)二肽(1-亮氨酰-1-脯氨酸)。雖然目前該方法仍然存在分離生物高分子效果不理想的短板,但相信接下來的幾年將會有所突破。
與其他層析方法相比,硅膠柱層析法具有操作簡便,樣品承載量大,封閉操作有機溶劑揮發(fā)少,成本低等優(yōu)點,是天然產(chǎn)物分離純化的首選方法之一。其分離原理是依據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而導(dǎo)致活性物質(zhì)與硅膠表面的許多游離狀態(tài)和活性狀態(tài)的基團(tuán)發(fā)生不同強度的相互作用,從而使物質(zhì)分離。通常情況下,相比極性較弱的物質(zhì),極性較大的物質(zhì)更易被硅膠吸附,總體層析過程實際上就是吸附、解吸、再吸附、再解吸。至今,硅膠柱層析分離技術(shù)在放線菌活性物質(zhì)分離領(lǐng)域已有很多典型應(yīng)用。Ravi等借助三氯甲烷萃取和硅膠柱層析從海洋鏈霉菌(sp.) VITLGK012中分離提純出對普通變形桿菌表現(xiàn)出高效抗菌活性的含氮化合物gancidinW。Suga等使用該方法從內(nèi)生放線菌(sp.) K12-0794 的發(fā)酵液中分離出了2個新的化合物,分別稱為hamuramicins A和hamuramicins B,均顯示出對水稻條紋病原菌有生長抑制活性。憑借其低成本、易操作等優(yōu)點,再加上分離效果佳,硅膠柱層析方法已經(jīng)受到國內(nèi)外眾多研究者的青睞。
大孔吸附樹脂是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種非離子型高分子聚合物吸附劑,具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積,主要利用范德華力和氫鍵形成的吸附力從溶液中有選擇地吸附有機物質(zhì),來實現(xiàn)分離提純化合物的目標(biāo)。其不僅理化性質(zhì)穩(wěn)定,應(yīng)用范圍廣,而且對有機物選擇性較好,可重復(fù)使用。將大孔吸附樹脂吸附技術(shù)應(yīng)用于放線菌活性物質(zhì)的分離具有較大的發(fā)展?jié)摿Γ壳耙呀?jīng)有許多研究者利用該方法分離純化出抗生素、生物堿類、黃酮類等成分。Chen等利用該方法從STZ中分離提純到對煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,簡稱TMV)表現(xiàn)出有效抗病毒活性的化合物-聚-1-賴氨酸。牛世全等利用三氯甲烷萃取和大孔吸附樹脂吸附法對放線菌 DA4-3-12 產(chǎn)生的活性物質(zhì)進(jìn)行初步分離,得到對植物病原真菌有良好抑制效果的脂溶性活性物質(zhì)。從近幾年的文獻(xiàn)報道來看,大孔吸附樹脂吸附法用于放線菌活性物質(zhì)的分離純化研究往往能取得不錯的結(jié)果,但樹脂成本較高,品種有限,分離操作較為復(fù)雜,今后若能開發(fā)出價格實惠、高選擇性的樹脂,則可為活性物質(zhì)的分離提供一條實用的技術(shù)途徑。
高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,簡稱HPLC)是一種以液體為流動相,基于儀器方法的高效能分離手段。該技術(shù)最早形成于20世紀(jì)70年代初,是在氣相色譜和經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,如今已是現(xiàn)代分離測試的重要手段。HPLC利用溶質(zhì)在固定相和流動相之間溶解度、吸附能力等的差異而引起不同程度的排阻作用使得不同成分在兩相間進(jìn)行連續(xù)多次交換時分離出來。不同的是,該方法在技術(shù)上采用了高性能色譜柱、高精度輸液泵、高靈敏度檢測器等,從而實現(xiàn)了分析速度快、分離效率高和操作自動化,這是其他色譜法很難達(dá)到的??傮w來說,該方法具有適用范圍廣、前處理簡單、分離度好、準(zhǔn)確度高、分析時間短、檢測通量高、兼具分離和分析功能、可在線檢測等優(yōu)勢。憑借這些優(yōu)勢,近年來研究者們逐漸傾向選擇該方法用于活性物質(zhì)的分離。2017年,Ahmad 等利用高效液相色譜法從sp. AGM12-1中分離純化到一種表現(xiàn)出顯著抗腫瘤活性的二酮吡嗪衍生物。同年Mohanasrinivasan等借助HPLC法在VITYGM的粗提物中檢測純化到一種肌動蛋白,具有應(yīng)用于治療心血管疾病的藥物開發(fā)的潛力。盡管高效液相色譜法應(yīng)用如此廣泛,并擁有眾多優(yōu)勢,但仍存在需要借助科技創(chuàng)新發(fā)展來改進(jìn)的地方,如分析成本和保養(yǎng)維護(hù)費用較高、存在“柱外效應(yīng)”(即在從進(jìn)樣到檢測器之間,除柱子以外的任何死空間中如進(jìn)樣器、柱接頭、連接管、檢測池等,如果流動相的流型有變化,被分離物質(zhì)的任何擴散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬)、柱效率降低等。
放線菌作為一類重要且具有巨大產(chǎn)生天然活性物質(zhì)潛能的微生物資源被人們愈加重視,其產(chǎn)生的天然活性物質(zhì)因具有抑菌、殺蟲、抗腫瘤活性、免疫抑制調(diào)節(jié)、食品防腐及其他多種重要活性而備受關(guān)注,放線菌及其天然活性代謝產(chǎn)物的探索已經(jīng)成為一個熱點研究領(lǐng)域。盡管對放線菌及其活性產(chǎn)物的研究越來越深入,天然活性物質(zhì)的挖掘、分離技術(shù)愈來愈先進(jìn),但也存在一定問題,在此筆者提出一些建議:(1)目前放線菌產(chǎn)生的諸多活性物質(zhì)仍未被挖掘或者很難分離提取出來,這就要求科研工作者不斷開發(fā)新技術(shù),尋找好方法,將天然活性物質(zhì)的挖掘、分離技術(shù)作為重點研究對象,結(jié)合時代前沿技術(shù),不斷創(chuàng)新。(2)放線菌產(chǎn)生的天然活性物質(zhì)雖然種類多、活性高、用途廣,但進(jìn)行規(guī)?;墓I(yè)化生產(chǎn)并投放到市場上的產(chǎn)品微乎其微,今后應(yīng)當(dāng)利用生物工程及發(fā)酵工程等技術(shù),研究適合目標(biāo)放線菌的發(fā)酵條件,加快天然活性物質(zhì)的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。(3)放線菌新型天然活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)概率較低,很難滿足新藥或者新殺菌劑和殺蟲劑等開發(fā)的需求,除了創(chuàng)新活性物質(zhì)挖掘技術(shù)外,還可以前往高溫高壓、無光照等極端自然環(huán)境以及深?;鹕健O地海洋等處于原始狀態(tài)的地區(qū),尋找新菌,挖掘新物質(zhì)。