西藏青稞穗腐病病原菌鑒定與室內(nèi)藥劑篩選

杜 娟， 申李旖琦， 聶麗妍， 魏麗萍， 孫 玉， 鞏文峰

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院植物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000； 2.資源與環(huán)境學(xué)院，西藏林芝 860000)

青稞(var.Hooker f.)，別稱裸大麥、米麥、元麥，主要分布在青藏高原的西藏和青海一帶，是西藏主要的糧食作物之一，占西藏糧食作物總播種面積的61.50%。目前，隨著西藏經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展以及人民生活水平的日益提高，對于青稞等的糧食需求在不斷增加，農(nóng)民種植青稞的生產(chǎn)積極性有明顯升高，但隨之而來的農(nóng)作物病蟲害成為影響糧食作物產(chǎn)量的阻礙，在眾多病蟲害中，發(fā)現(xiàn)一種由真菌引起的青稞穗部病害——青稞穗腐病，該病害也在玉米、水稻、小麥上普遍發(fā)生。1936年我國首次有小麥赤霉病發(fā)生的相關(guān)報道，該病主要發(fā)生在長江中下游麥區(qū)，不僅造成小麥的嚴(yán)重產(chǎn)量損失，而且病原菌產(chǎn)生毒素造成人畜中毒。小麥赤霉病是由多種鐮刀菌引起的，報道較多的致病菌有禾谷鐮刀菌復(fù)合群(species complex)、黃色鐮刀菌()、串珠鐮刀菌()和燕麥鐮刀菌()、梨孢鐮刀菌()和雪腐鐮刀菌()以及其余27種鐮刀菌菌種或變種，其中禾谷鐮刀菌是我國小麥赤霉病的主要致病種。

近年來，青稞穗腐病是在西藏青稞種植區(qū)發(fā)現(xiàn)的危害逐漸嚴(yán)重的一種穗部病害，目前對該病害的病原研究還不清晰。由鐮刀菌所引起的青稞穗腐病在2009年甘肅省甘南藏族自治州局部青稞地塊首次發(fā)現(xiàn)，在西藏日喀則、青海省、四川甘孜州等青稞種植區(qū)域都有發(fā)現(xiàn)，穗腐病的危害不斷加重，且流行區(qū)域總體不斷擴(kuò)散蔓延。同時，在病害流行區(qū)，一般青稞田塊病穗率為1%～5%，局部病穗率高達(dá)10%～15%。陳琳等確定青稞穗腐病的病原是禾生指葡孢霉，本研究中也分離觀察到這種病原，且發(fā)現(xiàn)一種新的致病菌。本研究對從西藏自治區(qū)山南市隆子縣和日喀則市江孜縣青稞種植區(qū)采集的發(fā)病麥穗分離病原菌，對該病原菌鑒定分析，研究碳氮源對病原菌菌絲生長的影響，選取6種不同殺菌劑進(jìn)行防治試驗，以期為青稞穗腐病診斷、防治和抗病機制等工作提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在2020年8月至2021年7月間于西藏農(nóng)牧學(xué)院植物病理實驗室進(jìn)行。青稞穗腐樣品采自西藏自治區(qū)山南市隆子縣(28°31′35.97″N，92°15′32.37″E)和日喀則市江孜縣(28°54′18.95″N，89°37′7.95″E)，經(jīng)緯度取縣中其中1個采樣地，平均海拔在4 000 m。在每個樣點中用五點取樣法，從100株青稞中記錄發(fā)病的青稞株數(shù)，取平均值求該樣品點的穗腐并發(fā)病率并記錄。將采集樣品分別裝袋、編號、記錄，置于4 ℃車載冰箱暫時保存，回到實驗室，放置于4 ℃冰箱中，以待分離。

選取以下培養(yǎng)基進(jìn)行分離、鑒定。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、7～20 g瓊脂1、1 000 mL水。

康乃馨葉片瓊脂(CLA)：水1 000 mL、瓊脂 17～20 g、康乃馨葉片。處理方法：將新鮮的康乃馨葉片用自來水清洗干凈，切成5 mm×5 mm左右的小片，放入干燥箱中，45～55 ℃烘干2 h左右，待葉片干燥且不失綠后，用環(huán)氧丙烷熏蒸滅菌2 h。將滅菌后的葉片置于滅菌培養(yǎng)皿中，倒入45 ℃ 1.5%～2%水瓊脂，培養(yǎng)基冷卻后，在靠近葉片處進(jìn)行接種。

合成低營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(SNA，用于觀察小孢子，厚垣孢子)：1 g KHPO、1 g KNO、0.5 g MgSO·7HO、0.5 g KCl、0.2 g葡萄糖、0.2 g蔗糖、20 g瓊脂。

查氏培養(yǎng)基(CDA)：30 g/L蔗糖、20 g/L瓊脂、2 g/L NaNO、1 g/L KHPO、0.5 g/L MgSO·7HO、0.5 g/L KCl、0.01 g/L FeSO。

1.2 病原菌的分離純化

采用菌絲頂端純化法分離真菌。將從西藏山南市隆子縣和日喀則市江孜縣采集的感病麥穗首先剪去多余麥芒，用滅菌蒸餾水沖洗3～4次后用滅菌濾紙吸干其表面水分，然后將患病麥穗放置于培養(yǎng)皿內(nèi)保濕，待有菌絲長出后進(jìn)行鏡檢和形態(tài)鑒定。之后用接種針挑取菌絲或孢子接到滅菌PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離，待長出菌落進(jìn)行純化，并斜面保存在4 ℃冰箱待用。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株接在PDA平皿上，28 ℃培養(yǎng)7 d，并觀察其在PDA上的生長性狀，如菌落形態(tài)、質(zhì)地、有無色素產(chǎn)生。用接種針挑取菌絲(乙醇燈旁操作)，放置于滴在載玻片上的水滴中，在尼康Ni-U生物顯微鏡下進(jìn)行觀察。參照Leslie的《the Fusarium Laboratory Manual》對分離的病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。通過顯微鏡觀察鐮刀菌小型分生孢子的形態(tài)、大型分生孢子的分隔、彎曲程度、基孢足根以及分枝形態(tài)等特征并進(jìn)行拍照、記錄。

1.4 分子鑒定及進(jìn)化分析

將供試病原菌接種在盛有PDB的液體培養(yǎng)基里，28 ℃、260 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，過濾收集菌絲。用CTAB法提取病原菌總DNA，利用真菌ITS通用引物ITS1(5′-T C C G T A G G T G A A C C T G C G G-3′)和ITS4(5′-T C C T C C G C T T A T T G A T A T G C-3′)以及 EF-1α 序列：EF-1H(5′-A T G G G T A A G G A A G A C A A G A C-3′)和EF-2T(5′-G G A A G T A C C A G T G A T C A T G T T-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用30 μL PCR反應(yīng)體系：模板DNA 1 μL、DNA聚合酶1 5 μL、PCR Forward Primer(10 μmmol/L)1 μL、PCR Reverse Primer (10 μmol/L)1 μL、ddHO加至 30 μL。PCR程序如下：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，50 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸 1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃下延伸7 min，4 ℃下保存。序列擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，膠回收得到純化PCR產(chǎn)物，送公司進(jìn)行序列測定。

將測序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)框(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)與已報道菌株進(jìn)行同源性比較，用MEGA 7.0軟件進(jìn)行多序列比對，采用Neighbor-Joining法和UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.5 病原菌生物學(xué)特性研究

病原菌生物學(xué)特性采用菌絲生長速率法進(jìn)行，用直徑5 mm打孔器打取菌餅，分別接種在以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的平板上，分別以葡萄糖、果糖、麥芽糖和淀粉來替換碳源，以牛肉膏、酵母膏、氯化銨、硝酸鉀和蛋白胨來替換氮源，28 ℃下培養(yǎng) 7 d，采用十字交叉法測菌落直徑，并計算平均值，每個處理3次重復(fù)。

1.6 病原菌藥劑防治的室內(nèi)篩選及毒力測定

將以上6種農(nóng)藥統(tǒng)一稀釋成1 g/L的農(nóng)藥溶液，將其加入到滅菌未凝固的PDA中，做成農(nóng)藥培養(yǎng)基，靜置4 h后進(jìn)行菌餅接種，在28 ℃中培養(yǎng)5～7 d，記錄農(nóng)藥對菌株生長的抑制效果。

通過公式計算菌落生長速率：

菌落生長速率=(-)7。

式中：為菌落直徑；為菌餅直徑；7為培養(yǎng)天數(shù)。

通過公式計算菌絲生長抑制率：

式中：為對照組菌落增長直徑；為處理組菌落增長直徑。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)利用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，用OriginPro 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 危害癥狀及形態(tài)學(xué)鑒定

田間采集青稞穗腐病發(fā)病癥狀主要有2種不同的類型，一種是具有粉紅色霉層：麥穗從孕穗期表現(xiàn)出癥狀，包裹麥穗的殼出現(xiàn)病斑。發(fā)病部位中央有粉紅霉層，四周出現(xiàn)褐色病斑，空穗且發(fā)病麥粒的麥芒呈現(xiàn)白化，存在畸形現(xiàn)象。另一種癥狀是無粉紅色霉層：從孕穗期開始發(fā)病，初期表現(xiàn)為麥穗上部及麥芒發(fā)病，呈現(xiàn)黃褐色病斑，后期發(fā)病部位擴(kuò)散至整個麥穗，黃褐色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榘咨?，?yán)重時出現(xiàn)空穗，發(fā)病麥粒的麥芒逐漸白化(圖1)。

由表1可知，山南市隆子縣的3個樣點的穗腐病發(fā)病率達(dá)5.53%；日喀則市江孜縣的穗腐病發(fā)病率6.4%。

表1 采集點調(diào)查青稞發(fā)病率

青稞穗腐病病原菌在PDA培養(yǎng)基28 ℃下培養(yǎng)7 d后進(jìn)行鏡檢。經(jīng)過觀察，在西藏江孜、隆子2個地方采集的發(fā)病麥穗上都是同一類鐮刀菌，所以進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子鑒定中將不再區(qū)分地方。通過在培養(yǎng)基上所觀察到的菌落性狀為菌落近圓形，菌絲體白色、毛絮狀、生長旺盛，而外圍一圈的菌絲體生長稀疏，且底部能產(chǎn)生少量紅色或黃色色素(圖2-C)。通過生物顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，小孢子多，呈卵形、棍棒狀，分隔為0～1隔，多數(shù)1隔(圖2-B)。小型分生孢子的彎曲程度不一，多數(shù)較直，分隔多數(shù)1～3隔，基孢足根明顯(圖2-A)。結(jié)構(gòu)情況主要是單瓶梗產(chǎn)孢，厚垣孢子球形，單個頂生(圖2-D)。綜上，待測菌株與燕麥鐮刀菌()形態(tài)相似。

2.2 分子鑒定

將所采集的青稞發(fā)病麥穗上提取的菌株送公司檢測，得到DNA測序結(jié)果分別進(jìn)行與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對結(jié)果，用MEGA 7.0軟件進(jìn)行多序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖3可知，在1 000次重復(fù)檢驗的前提下，分支上側(cè)數(shù)字為大于50%的Bootstrap檢驗值，遺傳距離為0.01，供試菌株與登錄號為MG274300.1的菌株燕麥鐮刀菌處于同一分支，親緣關(guān)系較近，同源性達(dá)96%。但該菌株與登錄號為KT192246.1的三線鐮刀菌()和登錄號為MK764994.1的銳頂鐮刀菌()也處于同一分支上，且相似性相同。因此ITS基因測序的系統(tǒng)發(fā)育樹無法區(qū)分開該菌株種類，需通過EF-1基因測序結(jié)果進(jìn)一步分析區(qū)分。

經(jīng)EF-1測序序列進(jìn)行比對分析，Bootstrap為1000次檢驗時，遺傳距離為0.05(圖4)，供試菌株與登錄號為MT237815.1的菌株燕麥鐮刀菌處于同一分支，且可信度高達(dá)100%，親緣關(guān)系更近。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)UPGMA法所作系統(tǒng)發(fā)育樹與N-J法結(jié)果一致(圖5)。綜合以上3種分析結(jié)果以及形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，可以初步得出該穗腐病病原菌為鐮刀菌屬中的燕麥鐮刀菌()。

2.3 不同碳源、氮源對菌絲生長的影響

試驗設(shè)置4個碳源處理，3次重復(fù)，在28℃下培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑結(jié)果。結(jié)果表明，同一類菌在不同碳源培養(yǎng)基上生長有差異，不同地方采集的同一類菌在同一碳源培養(yǎng)基上生長也有差異。在隆子采集的病原菌最適宜生長的碳源是葡萄糖和麥芽糖；在江孜采集的病原菌最適宜生長的碳源是淀粉(圖6)。

試驗設(shè)置5個碳源處理，3次重復(fù)，在28 ℃下培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑。結(jié)果表明，同一類菌在不同氮源培養(yǎng)基上生長有差異，不同地方采集的同一類菌在同一氮源培養(yǎng)基上生長也有差異。在隆子采集的病原菌最適宜生長的氮源是硝酸鉀；在江孜采集的病原菌最適宜生長的氮源是蛋白胨(圖7)。值得注意的是，氯化銨對于燕麥鐮刀菌的作用是抑制的，與其他氮源有明顯的不同。

2.5 藥劑防治室內(nèi)篩選

2.6 藥劑防治的毒力測定

表2 不同藥劑防治室內(nèi)毒理測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本研究以從西藏山南市隆子縣、日喀則市江孜縣采集到的青稞感病麥穗上分離到的病原物為對象，研究該病原物的形態(tài)和分子鑒定，并初步研究其生物學(xué)特性和毒力測定。綜合該病原物的形態(tài)學(xué)鑒定與ITS/EF-1基因序列分子鑒定結(jié)果，可初步確定該病原物屬于鐮刀菌屬的燕麥鐮刀菌。在生物學(xué)特性研究中發(fā)現(xiàn)該病原菌能利用葡萄糖、麥芽糖等多種單糖、多糖作為碳源；能利用有機氮蛋白胨和無機氮硝酸鉀作為氮源，符合燕麥鐮刀菌的特性。這與龔弘強等的研究結(jié)果一致。引起麥類穗腐的病原一般都是由多種病原引起的，如河南省小麥的穗腐病病原由5種鐮刀菌組成，而在大麥上有11種鐮刀菌可引起大麥赤霉病，早在1951年Bakshi認(rèn)為燕麥鐮刀菌()是主要危害大麥的病原物，本研究也主要分離到了燕麥鐮刀菌。目前還沒有明確燕麥鐮刀菌是否是導(dǎo)致青稞穗腐病發(fā)生的優(yōu)勢致病病原菌，為進(jìn)一步驗證，還需要經(jīng)過柯赫氏法則驗證。

在室內(nèi)毒力測定試驗中發(fā)現(xiàn)，藥劑篩選結(jié)果與毒力測定結(jié)果大致相似，初步確定苯醚甲環(huán)唑?qū)ρ帑滅牭毒幸种谱饔?，且抑制效果較其他種類農(nóng)藥好，可能成為防治首選藥劑。苯醚甲環(huán)唑的田間防效評價試驗是接下來的試驗方向，為防治青稞穗腐病的農(nóng)藥種類提供參考。

但由于農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)中的廣泛使用，其毒性和環(huán)境污染問題越來越受到人們的關(guān)注。苯醚甲環(huán)唑是一種廣譜殺菌劑，屬于三唑類化學(xué)物質(zhì)。苯醚康唑是典型的三唑類殺菌劑之一。這種殺菌劑以種子處理和葉面噴灑的形式對真菌群非常有效。由于其廣譜活性，苯醚康唑已被廣泛用于各種農(nóng)作物。三唑類殺菌劑通過抑制細(xì)胞色素P450酶(CYP450)活性來抑制麥角甾醇的生物合成，最終抑制真菌的生長。因此，它被廣泛用于防治水果、蔬菜和人類的真菌病害。Wang等研究了苯醚甲環(huán)唑?qū)θ梭w細(xì)胞的毒性，通過對DNA損傷、細(xì)胞凋亡等進(jìn)行了測試。DNA損傷會導(dǎo)致衰老、神經(jīng)退化、癌癥和其他相關(guān)疾病。根據(jù)DNA損傷的起源，主要包括2個方面：一是環(huán)境影響引起的外源性DNA損傷；另一種是自發(fā)損傷引起的內(nèi)源性DNA損傷。農(nóng)藥引起的DNA損傷屬于第2類。雖然推薦使用苯醚甲環(huán)唑殺菌劑，但現(xiàn)在不提倡大量使用農(nóng)藥進(jìn)行防治，筆者后續(xù)就穗腐病的根際微生物和內(nèi)生菌進(jìn)行相關(guān)研究，從中可以發(fā)現(xiàn)對燕麥鐮刀菌有明顯抑制效果的拮抗菌株，進(jìn)行生防制劑的研究。

青稞是西藏地區(qū)主要的糧食作物，青稞的產(chǎn)量和品質(zhì)直接影響當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)和百姓的生活水平。燕麥鐮刀菌所導(dǎo)致的青稞穗腐病此前在我國西藏地區(qū)還未見報道，青稞穗腐病原組成多樣性、致病性和致病力目前還不清楚，該病原菌的侵染循環(huán)、致病機理以及該病原菌是否是由種子帶菌引起的等問題是未來進(jìn)一步研究的方向。