天津地區(qū)帕金森病患者GRIN2A、GRIN2B基因rs4998386位點(diǎn)多態(tài)性觀察

肖穎，張本恕

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300052

目前研究認(rèn)為，帕金森?。≒D）動(dòng)物模型中N-甲基-D-谷氨酸受體（NMDAR）表達(dá)可導(dǎo)致PD癥狀變化，黑質(zhì)紋狀體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)阻斷后可減輕PD的運(yùn)動(dòng)障礙癥狀[1]。谷氨酸鹽介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性與PD的退行性變有著密切關(guān)聯(lián)。而這種興奮性是由NMDAR所調(diào)控。NMDAR是谷氨酸門控的離子型谷氨酸鹽受體[2]，它幾乎參與腦的所有功能[3]。NMDAR谷氨酸位點(diǎn)亞單位活化和因子轉(zhuǎn)換表達(dá)，可調(diào)節(jié)谷氨酸鹽釋放，在介導(dǎo)PD患者大腦谷氨酸鹽的神經(jīng)傳遞功能中起一定作用[4]。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，PD患者多巴胺能神經(jīng)元的退行性變可能是由NMDAR單核苷酸多態(tài)性所致。因此，本研究對(duì)PD患者編碼NMDAR關(guān)鍵亞基NR2A、NR2B的GRIN2A、GRIN2B基因rs4998386位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行觀察，并分析其與天津地區(qū)PD發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2012年7月—2013年8月神經(jīng)內(nèi)科收治的PD患者納入研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合英國(guó)PD協(xié)會(huì)腦庫(kù)的PD臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]和2016年我國(guó)制定的PD診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，隨診至少1年以上。共104例PD患者進(jìn)入研究（PD組），男60例、女44例，年齡65～ 80（76.5±5.7）歲，無(wú)其他器質(zhì)性疾病及不良病史。選擇同期門診查體健康者110例納入對(duì)照組，男64例、女46例，年齡65～80歲（74.8±4.6）歲。入選研究對(duì)象均為天津地區(qū)漢族人群，兩組性別、年齡等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2012-6），所有研究對(duì)象對(duì)本研究知情同意并簽署基因檢測(cè)同意書。

1.2 GRIN基因rs4998386位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)方法

1.2.1 DNA的提取 取兩組EDTA抗凝靜脈血2 mL，用TKM法提取基因組DNA。

1.2.2 GRIN2A基因rs4998386位點(diǎn)T/C多態(tài)性觀察 上游引物序列為5'-CTCTGCCATGCAAAACACAC-3'、下游引物序列為5'-TGGAAATCCAGTTGAATAACATT-3'。反應(yīng)條件為94℃ 5 min；94℃58 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 59 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。得到長(zhǎng)217 bp的PCR產(chǎn)物。將10μL的PCR產(chǎn)物與10 U MboI 37℃共同水浴8 h，2%瓊脂糖凝膠分離酶切產(chǎn)物。T等位基因?yàn)槌霈F(xiàn)129、88 bp的2個(gè)條帶，C等位基因僅出現(xiàn)217 bp的1個(gè)條帶。

1.2.3 GRIN2B基因rs4998386位點(diǎn)T/G多態(tài)性觀察 上游引物序列為5'-GGTGGCAACTATTACATTCT-3'、下游引物序列為5'-CTTTACCACCACCAAATCCC-3'。反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s、58 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 6 min。得到長(zhǎng)193 bp的PCR產(chǎn)物。將10μL的PCR產(chǎn)物與10 U Hph Ⅰ37℃共同水浴8 h，2%瓊脂糖凝膠分離酶切產(chǎn)物。T等位基因?yàn)槌霈F(xiàn)125、68 bp的2個(gè)條帶，G等位基因無(wú)Hph Ⅰ酶切點(diǎn)，只出現(xiàn)193 bp的1個(gè)條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在Dbase軟件中建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。率的比較采用χ2檢驗(yàn)或校正χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組GRIN2A基因rs4998386位點(diǎn)T/C多態(tài)性分布比較 PD組與對(duì)照組基因頻率及基因型頻率關(guān)系均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P均＞0.05）。PD組GRIN2A基因rs4998386位點(diǎn)T等位基因和TC基因型分布頻率均高于對(duì)照組（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組GRIN2A基因rs4998386位點(diǎn)T/C多態(tài)性分布比較[例（%）]

2.2 兩組GRIN2B基因rs4998386位點(diǎn)T/G多態(tài)性分布比較 PD組與對(duì)照組各等位基因和基因型分布頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 兩組GRIN2B基因rs4998386位點(diǎn)T/G多態(tài)性分布頻率比較[例（%）]

3 討論

PD是較常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。既往研究認(rèn)為，PD是遺傳基因和環(huán)境相互作用的結(jié)果，而越來(lái)越多的研究證實(shí)，PD的發(fā)病與基因有關(guān)。目前，越來(lái)越多的證據(jù)支持谷氨酸鹽氧化應(yīng)激在PD發(fā)病與進(jìn)展中的作用。NMDAR是谷氨酸門控的離子型谷氨酸鹽受體[2]，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多功能有關(guān)，其基因變異尤其亞型基因變異與神經(jīng)系統(tǒng)功能異常密切相關(guān)[3]。

近年對(duì)NMDAR基因多態(tài)性、腦脊液水平變化及相關(guān)免疫方面的研究結(jié)果顯示，NMDAR在細(xì)胞退行性改變的發(fā)生中發(fā)揮作用[7-8]。NMDAR高表達(dá)可以影響黑質(zhì)紋狀體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)阻斷，進(jìn)而糾正PD的運(yùn)動(dòng)障礙癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，NMDAR離子門控通道是異聚體，主要由NR1、NR2亞單位組成，編碼基因分別為GRIN1、GRIN2。GRIN2又有4個(gè)亞型即GRIN2A、GRIN2B、GRIN2C、GRIN2D。大量NMDAR連續(xù)活化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量和代謝酶活性升高，觸發(fā)一系列反應(yīng)，包括線粒體細(xì)胞膜去極化、半胱氨酸谷氨酸蛋白酶活化、細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激增強(qiáng)、氧化代謝產(chǎn)物蓄積和氮離子自由基丟失，最終引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞變性、死亡。研究顯示，PD神經(jīng)元谷氨酸鹽相關(guān)能量代謝減低，谷氨酸鹽神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)和線粒體功能受損與PD的病理生理機(jī)制相關(guān)，PD的病理改變是神經(jīng)遞質(zhì)功能異常和能量代謝受損共同所致。一方面可能是由于其線粒體功能障礙，另一方面可能是由于基因變異導(dǎo)致神經(jīng)元功能或突觸間作用活性降低[9]。有假說認(rèn)為，谷氨酸受體激動(dòng)劑對(duì)突觸內(nèi)NMDAR亞基和紋狀體突觸具有可塑性，從而影響錐體外系神經(jīng)細(xì)胞功能，造成肌張力改變[10-11]。有學(xué)者通過對(duì)PD海馬細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，NMDAR含量過高可造成海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)、細(xì)胞退變和壞死[12]。

GRIN2A編碼NMDAR關(guān)鍵亞單位ε，GRIN2A基因rs4998386多態(tài)性與具有保護(hù)作用的咖啡堿相互作用可增加PD發(fā)生的危險(xiǎn)性。盡管目前研究沒有證實(shí)GRIN2A基因rs4998386多態(tài)性與PD的關(guān)聯(lián)[13-14]，但Meta分析認(rèn)為兩者之間很可能存在相關(guān)性[15-16]。在哺乳動(dòng)物中，GRIN2B可激活谷氨酸鹽的結(jié)合位點(diǎn)及主導(dǎo)興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)遞質(zhì)受體。GRIN2B基因變異在亞洲人群中常見[13]。多項(xiàng)研究認(rèn)為，GRIN2B基因變異與亞洲人群患PD有關(guān)。HASSAN等[17]認(rèn)為，GRINB基因多態(tài)性有望作為評(píng)估PD的標(biāo)志物。還有研究者認(rèn)為，PD患者的脈沖式控制和相關(guān)行為表現(xiàn)與GRINB基因多態(tài)性有關(guān)[18-19]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，針對(duì)NMDAR的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑均可減輕PD的癥狀。NMDAR拮抗劑對(duì)PD的抑郁、認(rèn)知等非運(yùn)動(dòng)癥狀也有明確干預(yù)效果，這更支持NMDAR與PD的關(guān)聯(lián)[20-24]。至今惟一用于臨床治療PD的抗谷氨酸鹽藥物為金剛烷胺，其可通過非競(jìng)爭(zhēng)性阻抗NMDAR[25]。因此，本研究鎖定近年NMDAR相關(guān)研究中關(guān)注較多的GRIN2A、GRIN2B基因的rs1805476位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析，旨在初步探尋PD發(fā)病的相關(guān)基因。

本研究選取天津地區(qū)確診的PD患者及健康對(duì)照者各104例，對(duì)他們的GRIN2A T/C和GRIN2B T/G基因位點(diǎn)基因型和等位基因進(jìn)行分析。本研究結(jié)果顯示，PD組GRIN2A基因rs4998386位點(diǎn)T等位基因和TC基因型分布頻率高于對(duì)照組；兩組GRIN2B基因rs4998386位點(diǎn)T/G各等位基因和基因型分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示GRIN2A基因rs4998386位點(diǎn)T等位基因和TC基因型可能與天津地區(qū)PD的遺傳易感性有關(guān)；而GRIN2B基因rs4998386位點(diǎn)T/G多態(tài)性可能與PD的發(fā)病關(guān)聯(lián)性不大。然而，鑒于地域、種族、樣本含量、實(shí)驗(yàn)技術(shù)等客觀因素的影響，以上研究結(jié)論仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。