miR-146a尾靜脈注射對(duì)阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知能力、Th17/Treg分布及炎癥因子水平的影響

謝平安，廖輝 ，張艷敏，杜從斌

1天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300192；2天津市第四中心醫(yī)院中醫(yī)科；3天津市黃河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

我國(guó)阿爾茨海默?。ˋD）發(fā)病率較高[1-2]。大部分AD患者初期會(huì)出現(xiàn)記憶能力及判斷能力減退，隨著病情發(fā)展，認(rèn)知功能、精神行為及生活能力逐漸降低[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，AD的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體炎癥及免疫反應(yīng)有一定關(guān)系[4]。還有研究發(fā)現(xiàn)，人大腦中含有一些miRNAs，與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并影響機(jī)體免疫過程及炎癥反應(yīng)[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-146a表達(dá)可減少癲癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，降低炎癥因子水平[6]。張斌[7]研究發(fā)現(xiàn)，AD 患者血miR-146a水平較低，認(rèn)為miR-146a在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前對(duì)于miR-146a影響AD的相關(guān)機(jī)制是否涉及免疫反應(yīng)和炎癥因子，尚無(wú)明確結(jié)論。2021年6月—12月，本研究觀察了miR-146a對(duì)AD大鼠認(rèn)知能力、輔助性T細(xì)胞（Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）分布及炎癥因子水平的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 健康雄性SD大鼠60只，鼠齡10～12周，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0011。本研究方案經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。Aβ25-35購(gòu)自上海皓元公司。miR-146a agomir購(gòu)自上海吉瑪公司。腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物公司。流式細(xì)胞分析儀（FACS Verse）購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.2 動(dòng)物分組、造模及給藥方法 將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、AD組、miR-146a+AD組，每組20只。給予大鼠自由攝食和飲水，12 h/12 h光暗循環(huán)，（21±2）℃下飼養(yǎng)7 d。大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后，AD組、miR-146a+AD組制作AD模型：將Aβ25-35稀釋成2μg/μL，用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹膜內(nèi)注射麻醉大鼠，剔除大鼠頭頂部被毛，切開頭皮，暴露顱骨，按照前囟進(jìn)行定位，前囟后0.8 mm、左右旁開1.5 mm處進(jìn)行標(biāo)記，注射器針頭在標(biāo)記處鉆取直徑約1 mm的小孔，挑破大鼠硬腦膜，于海馬區(qū)域注射Aβ25-35 5μL。假手術(shù)組僅開顱窗后注入等量生理鹽水，用骨蠟封閉。針孔使用牙托粉填補(bǔ)，使用慶大霉素防止傷口感染，將皮膚縫合并再次消毒。miR-146a+AD組隨即通過尾部靜脈一次性注射1×108PFU/mL的miR-146a agomir 100μL。

1.3 認(rèn)知能力評(píng)價(jià) 采用水迷宮實(shí)驗(yàn)。造模第1、2、3、4天進(jìn)行定位導(dǎo)航測(cè)試，將大鼠放入水中，記錄每只大鼠從起始點(diǎn)到平臺(tái)所用時(shí)間為逃逸潛伏期時(shí)間；若大鼠60 s內(nèi)無(wú)法找到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)至平臺(tái)并允許其在平臺(tái)停留15 s，將逃逸潛伏期記錄為60 s。造模第5天撤去平臺(tái)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將大鼠由距離平臺(tái)最遠(yuǎn)象限放入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.4 Th17/Treg分布測(cè)算 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集大鼠全血250μL，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，在37℃、5% CO2條件下中孵育4 h。離心，除去上清液后，加入紅細(xì)胞裂解緩沖液，于黑暗中溫育10 min。離心，去除上清液，加入FITC標(biāo)記的抗CD4并充分混合，2～8℃黑暗環(huán)境中孵育15 min。加入染色緩沖液重懸細(xì)胞，以1 200 r/min離心5 min。除去上清液，加入緩沖液混合，2～8℃黑暗環(huán)境中孵育20 min，加入1×滲透/洗滌緩沖液混合。離心，去上清液，留250μL液體，加入1×洗滌緩沖液重懸細(xì)胞。以1 200 r/min離心5 min，去上清液，加入染色緩沖液重懸細(xì)胞，加入PE標(biāo)記的抗體，黑暗中孵育30 min。加入1×滲透/洗滌緩沖液以重懸細(xì)胞，以1 200 r/min離心5 min，除去上清液。最后，加入染色緩沖液重懸細(xì)胞，過濾后上流式細(xì)胞儀分析。

1.5 海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6檢測(cè) 造模8周后，通過腹腔注射3%戊巴比妥鈉處死大鼠，斷頭取腦，冰上小心分離海馬組織，于-80℃保存。取海馬組織稱重，置于均化器中，得到裂解物于4℃下12 000 r/min離心20 min，收集上清液。使用ELISA法檢測(cè)上清液中的TNF-α、IL-1β、IL-6。設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔。將濃度為0的SO號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，樣本孔先加入待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL，空白孔不加。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋溫育65 min，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置2 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，依此重復(fù)6次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育10 min。每孔加入終止液50μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值，代表炎癥因子水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，采用Kolmogorov-Smirnov進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用Bartlett法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠認(rèn)知能力比較 AD組造模1～4 d逃逸潛伏期均長(zhǎng)于假手術(shù)組，目標(biāo)象限停留時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)少于假手術(shù)組；miR-146a+AD組逃逸潛伏期短于AD組，目標(biāo)象限停留時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)多于AD組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠認(rèn)知能力指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠認(rèn)知能力指標(biāo)比較（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與AD組相比，#P＜0.05。

組別n 逃逸潛伏期（s）穿越平臺(tái)次數(shù)（次）7.15±1.03 4.12±0.98*6.14±0.96*#1 d 33.56±4.11 57.65±4.26*49.58±4.57*#2 d 25.08±3.62 50.63±4.09*44.26±3.89*#3 d 20.32±3.44 43.62±3.94*39.87±3.76*#4 d 18.15±3.02 40.83±3.67*31.75±3.66*#目標(biāo)象限停留時(shí)間（s）38.75±3.98 20.14±3.54*31.44±3.81*#假手術(shù)組AD組miR-146a+AD組20 20 20

2.2 各組大鼠血清Th17/Treg分布比較 AD組CD4+IL-17A+Th17比例低于假手術(shù)組、CD4+CD2 5+Foxp3+Treg比例高于假手術(shù)組；miR-146a+AD組CD4+IL-17A+Th17比例高于AD組、CD4+CD25+Foxp 3+Treg比例低于AD組（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清Th17/Treg分布比較（%，±s）

表2 各組大鼠血清Th17/Treg分布比較（%，±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與AD組相比，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組AD組miR-146a+AD組CD4+CD25+Foxp3+Treg 5.69±1.11 3.45±0.87*4.87±1.03*#n 20 20 20 CD4+IL-17A+Th17 1.22±0.39 2.16±0.64*1.81±0.58*#

2.3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 AD組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于假手術(shù)組，miR-146a+AD組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于AD組（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與AD組相比，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組AD組miR-146a+AD組TNF-α 30.48±5.91 60.23±8.87*41.37±7.13*#n 20 20 20 IL-1β 21.62±3.98 42.08±6.26*37.62±5.97*#IL-6 23.56±4.41 57.44±7.39*42.50±6.14*#

3 討論

AD是一種發(fā)病原因復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)期的慢性炎癥，且小膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)期過度激活也能促進(jìn)炎癥介導(dǎo)的認(rèn)知功能損傷和細(xì)胞毒性[8]。AD的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在腦組織中表達(dá)豐富，能調(diào)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)多個(gè)靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化，而神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)miRNAs相關(guān)蛋白表達(dá)異常與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[9]。miR-146a為被認(rèn)為是首個(gè)具有免疫調(diào)節(jié)作用的miRNAs，在固有炎癥、免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程中具有重要作用[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a在一些疾病中具有抑制腦部炎癥的功能。劉翀等[11]研究表明，新生缺氧缺血性腦病大鼠miR-146a表達(dá)顯著低于正常大鼠，上調(diào)miR-146a表達(dá)可通過抑制神經(jīng)炎癥而減輕癥狀，認(rèn)為miR-146a具有一定抗炎效果。但對(duì)于miR-146a在AD中的表達(dá)和相關(guān)調(diào)控機(jī)制，目前尚不清楚。

本研究觀察了miR-146a對(duì)AD大鼠認(rèn)知能力、Th17/Treg分布及炎癥因子水平的影響，結(jié)果顯示，AD組造模1～4 d逃逸潛伏期均長(zhǎng)于假手術(shù)組，目標(biāo)象限停留時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)少于假手術(shù)組；miR-146a+AD組逃逸潛伏期短于AD組，目標(biāo)象限停留時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)多于AD組。水迷宮實(shí)驗(yàn)可反映大鼠的認(rèn)知能力、記憶力及學(xué)習(xí)能力[12-13]，上述結(jié)果表明，通過升高miR-146a表達(dá)可明顯改善AD大鼠的認(rèn)知能力，miR-146a表達(dá)上調(diào)對(duì)AD癥狀具有一定干預(yù)作用。

同時(shí)，我們也觀察到AD大鼠的Th17/Treg平衡出現(xiàn)改變，AD大鼠建模后Th17比例升高，Treg比例降低，這表明AD會(huì)導(dǎo)致免疫紊亂。溫國(guó)輝等[14]通過比較58例AD患者和30例健康受試者的Th17/Treg，發(fā)現(xiàn)AD患者外周血Th17比例高于健康受試者，Treg比例低于健康受試者，與本研究結(jié)果一致。這是由于AD核心發(fā)病機(jī)制為β淀粉樣蛋白異常聚集，可造成慢性炎癥，同時(shí)有研究指出AD患者外周血可出現(xiàn)β淀粉樣蛋白特異性T細(xì)胞比例升高，表現(xiàn)為自體免疫性疾病癥狀，導(dǎo)致Th17/Treg失衡[15]。薄純銳等[16]指出，miR-146a對(duì)機(jī)體免疫有調(diào)控作用，從而參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病。本研究結(jié)果顯示，miR-146a+AD組CD4+IL-17A+Th17比例高于AD組，CD4+CD25+Foxp3+Treg比例低于AD組，提示miR-146a可能通過調(diào)節(jié)Th17/Treg發(fā)揮治療作用。

Th17細(xì)胞可通過產(chǎn)生多種促炎因子（如IL-6、IL-17、IL-21等）參與各種炎癥性疾病的發(fā)展，而AD的發(fā)生多與腦組織內(nèi)神經(jīng)元持續(xù)炎癥反應(yīng)有關(guān)[17]。因此，我們對(duì)各組大鼠海馬組織炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AD組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著高于對(duì)照組，這表明AD大鼠合并腦部炎癥，與既往研究類似[18]。TNF-α可通過觸發(fā)各種信號(hào)通路，激活炎癥反應(yīng)，刺激IL-6、IL-1β表達(dá)[19]。GUAN等[20]研究認(rèn)為，AD等神經(jīng)退行性疾病會(huì)因先天免疫介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥促進(jìn)疾病的發(fā)生及進(jìn)展，通過激活小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥因子釋放，激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3通路，導(dǎo)致神經(jīng)變性。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-146a表達(dá)后，大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低，提示上調(diào)miR-146a表達(dá)可減輕AD大鼠的腦部炎癥。研究表明，miR-146a作為NF-κB依賴性基因，能通過抑制IL-1受體相關(guān)激酶1、人類單核細(xì)胞腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6從而下調(diào)NF-κB表達(dá)，減輕腦組織內(nèi)神經(jīng)元持續(xù)炎癥；同時(shí)，miR-146a可靶向作用于補(bǔ)體因子H、β-APP相關(guān)蛋白，減輕AD大腦炎癥[21]。

綜上所述，miR-146a可改善AD大鼠的認(rèn)知能力，調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，減輕AD腦部炎癥。然而，miR-146a對(duì)AD的治療作用影響到哪些信號(hào)通路目前尚不明確，既往研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/Gsk3β信號(hào)通路、p38 MAPK信號(hào)通路均為影響AD的信號(hào)通路[22-23]，我們今后的研究將會(huì)對(duì)這些信號(hào)通路進(jìn)行探索。此外，一些治療AD的藥物是否會(huì)對(duì)miR-146a產(chǎn)生影響或通過miR-146a發(fā)揮作用，也有望在之后的研究中進(jìn)一步明確。