FBW7基因敲除的放射誘導(dǎo)性胃腸綜合征小鼠腸道損傷變化及其機(jī)制

章屹然，王兆熹，彭涵，朱軍，張健，李惠晨

1空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，西安 710032；2空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院整形外科；3空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化外科

當(dāng)腸道絨毛上皮細(xì)胞和隱窩干細(xì)胞受到一定劑量的電離輻射（如γ、β射線），其生長、增殖受到抑制甚至死亡，造成腸道屏障功能喪失、上皮缺損和炎癥損傷，從而導(dǎo)致胃腸綜合征（GIS）的發(fā)生，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，甚至威脅患者生命[1-2]。目前尚無有效醫(yī)學(xué)手段用于GIS的治療，這也成為腹部腫瘤放射治療的主要限制因素[3]。因此，探索GIS的損傷機(jī)制，找到潛在的干預(yù)靶點(diǎn)，對開發(fā)有效的干預(yù)措施至關(guān)重要。泛素—蛋白酶體系統(tǒng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)降解的主要調(diào)控途徑[4]，其功能缺陷可能導(dǎo)致多種疾病[5]。FBW7屬于泛素連接酶E3復(fù)合體，其在腫瘤中的作用得到廣泛研究[6-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BW7通過調(diào)控NF-κB信號通路，在硫酸葡聚糖鈉鹽誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)BW7表達(dá)缺失能夠加重實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎[8]。然而，F(xiàn)BW7在放射誘導(dǎo)的GIS中的作用還不得而知。2018年3月—2021年6月，本研究觀察了FBW7基因敲除的放射誘導(dǎo)性GIS小鼠腸道損傷變化，并探討其相關(guān)機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與主要材料 6～8周齡、體質(zhì)量18.5～21.5 g的野生型雄性C57/BL小鼠60只，購于空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。小鼠在SPF條件下飼養(yǎng)，所有動物實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)管理委員會的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。胰酶、EDTA均購自Gibco公司；TUNEL免疫熒光檢測試劑盒、髓過氧化物酶（MPO）檢測試劑盒購自碧云天公司；ELISA試劑盒購自eBioscience公司；Caspase-3、Bax、Ki-67、PCNA等相關(guān)抗體購自Abcam公司。

1.2 動物分組及GIS模型制作 將FBW7基因兩端具有flox序列的C57/BL小鼠（FBW7fl/fl）與攜帶Cre重組酶、villin啟動子（Vil/Cre）的C57/BL小鼠雜交，經(jīng)過多次雜交產(chǎn)生Vil/Cre-FBW7fl/fl純合小鼠記為FBW7△G小鼠，實(shí)現(xiàn)腸道組織特異性FBW7敲除，取15只作為實(shí)驗(yàn)組。野生型C57/BL小鼠15只納入對照組。使用60Go放射源，以8 Gy（劑量率0.7 Gy/min）的劑量對兩組小鼠進(jìn)行一次性全腹部照射。將照射后小鼠放回單獨(dú)的籠子里，觀察并記錄小鼠體質(zhì)量變化、腹瀉情況和存活情況。分別于照射后7、14 d以脫頸法處死小鼠并取腸道組織做病理切片。HE染色顯示照射后小腸絨毛高度降低，腸道隱窩深度變淺，絨毛數(shù)目減少，窩腔變大，出現(xiàn)放射性腸炎改變，表明GIS造模成功。

1.3 小腸放射損傷評估 分別于每日早上8：00記錄每只小鼠的存活情況和體質(zhì)量變化，觀察腹瀉情況。腹瀉評分標(biāo)準(zhǔn)：無腹瀉計(jì)0分，大便松軟計(jì)1分，稀便、腹瀉計(jì)2分。照射后8 d，以脫頸法處死小鼠，打開腹腔，用剪刀小心切取小鼠小腸組織，生理鹽水沖洗，多聚甲醛固定、包埋后制成5μm厚的石蠟切片，進(jìn)行HE染色。通過Image J軟件測量小腸絨毛平均長度和隱窩平均深度，以評價(jià)損傷程度。光學(xué)顯微鏡下觀察并進(jìn)行小腸組織病理學(xué)評分，評分主要指標(biāo)包括上皮缺失百分?jǐn)?shù)（無缺失計(jì)0分，缺失＜5%計(jì)1分，缺失5%～10%計(jì)2分，缺失＞10%計(jì)3分）、隱窩損傷百分?jǐn)?shù)（無損傷計(jì)0分，損傷＜10%計(jì)1分，10%～20%計(jì)2分，＞20%計(jì)3分）、杯狀細(xì)胞損傷（無損傷計(jì)0分，輕微損傷計(jì)1分，中度損傷計(jì)2分，重度損傷計(jì)3分）、炎癥細(xì)胞浸潤（無浸潤計(jì)0分，輕微浸潤計(jì)1分，中度浸潤計(jì)2分，重度浸潤計(jì)3分）。

1.4 小腸上皮細(xì)胞MPO活性及IL-1β、IL-6、TNF-α檢測 采用MPO生化試劑盒檢測小腸上皮MPO活性，反映損傷黏膜嗜中性粒細(xì)胞浸潤程度。采用ELISA法檢測小腸上皮細(xì)胞中的IL-1β、IL-6、TNF-α。

1.5 腸道隱窩干細(xì)胞增殖檢測 取出腸道組織清洗干凈，甲醛固定，石蠟包埋，切片。將組織切片在二甲苯、無水乙醇和95%乙醇溶液中浸泡后，用去離子水洗滌進(jìn)行脫蠟。將切片在檸檬酸緩沖液中封閉，并用去離子水清洗封閉液。將切片在含5%山羊血清的TBST中室溫下封閉。用稀釋好的Ki-67（1∶200）、PCNA（1∶400）一抗在4 ℃下進(jìn)行封閉過夜，并用TBST溶液洗滌。加入1∶1 000稀釋的相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h后，用TBST溶液洗滌，滴加檢測試劑，室溫下于濕盒中放置30 min。顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)Ki-67、PCNA陽性細(xì)胞。

1.6 小腸上皮細(xì)胞凋亡檢測 取腸道組織進(jìn)行TUNEL染色，甲醛固定、切片、脫蠟，滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37℃溫箱孵育30 min進(jìn)行修復(fù)。將玻片置于PBS中，在脫色搖床上洗滌。切片稍甩干后滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20 min，將玻片置于PBS中，在脫色搖床上洗滌。按切片數(shù)量和組織大小取TUNEL試劑盒內(nèi)適量試劑1（TdT）和試劑2（dUTP）按2∶29混合，覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育2 h，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。切片用PBS洗滌。去除PBS后滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。玻片置于PBS中，在脫色搖床上洗滌。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞，反映腸道上皮細(xì)胞凋亡情況。采用免疫組化法檢測Caspase-3、Bax蛋白，Image J軟件分析Caspase-3、Bax蛋白平均光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用Shapro-Wilk法對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier曲線進(jìn)行生存分析，采用對數(shù)秩檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小腸放射損傷程度比較 實(shí)驗(yàn)組、對照組存活時(shí)間分別為（13.50±1.80）、（9.56±1.66）d，實(shí)驗(yàn)組存活時(shí)間較對照組更長（P＜0.05）。照射第10天后，實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量下降較對照組更快（P均＜0.05），見表1。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組腹瀉明顯減輕，見表2。實(shí)驗(yàn)組腸道（特別是小腸部）充血及水腫情況較對照組更輕，實(shí)驗(yàn)組、對照組小腸組織病理學(xué)評分分別為（6.33±1.38）、（8.77±1.31）分，實(shí)驗(yàn)組低于對照組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組和對照組照射后腸道絨毛長度及小腸隱窩深度都有減少，照射8 d后，實(shí)驗(yàn)組腸道絨毛長度及小腸隱窩深度均高于對照組（P均＜0.05），見表3。

表1 照射不同時(shí)間兩組小鼠體質(zhì)量變化程度比較（%，±s）

表1 照射不同時(shí)間兩組小鼠體質(zhì)量變化程度比較（%，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別實(shí)驗(yàn)組對照組第1天92.45±1.40 92.18±1.85 n 15 15第0天100.00±0.00 100.00±0.00第4天85.06±4.01 85.58±4.18第8天79.32±6.22 82.63±5.19第12天66.42±4.45*78.39±3.16第10天75.20±6.21*79.05±9.11

表2 照射不同時(shí)間兩組小鼠腹瀉評分比較（分，±s）

表2 照射不同時(shí)間兩組小鼠腹瀉評分比較（分，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別實(shí)驗(yàn)組對照組n 15 15第0天0.00±0.00 0.00±0.00第1天0.07±0.03 0.25±0.12第2天0.57±0.11 0.81±0.23第3天0.79±0.16*1.06±0.21第4天1.00±0.23*1.25±0.19

表3 照射前后兩組小腸絨毛高度和隱窩深度比較（μm，±s）

表3 照射前后兩組小腸絨毛高度和隱窩深度比較（μm，±s）

注：與同組照射第0天相比，*P＜0.05；與對照組照射第8天相比，#P＜0.05。

小腸絨毛高度n 小腸隱窩深度15 476.6±1.9 404.4±7.8*#組別實(shí)驗(yàn)組照射第0天照射第8天對照組照射第0天照射第8天100.3±3.5 76.1±1.9*#15 106.5±3.2 69.4±2.4*486.5±2.4 311.8±13.4*

2.2 兩組小腸上皮細(xì)胞MPO活性及IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)組小腸上皮細(xì)胞MPO活性及IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)均低于對照組（P均＜0.05）。見表4。

表4 兩組小腸上皮細(xì)胞MPO活性及IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)比較（±s）

表4 兩組小腸上皮細(xì)胞MPO活性及IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)比較（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別實(shí)驗(yàn)組對照組TNF-α（pg/mg）184.9±20.6*439.9±88.2 n 15 15 MPO（U/g）0.041 33±0.004 82*0.067 67±0.006 64 IL-1β（pg/mg）772.1±28.1*982.1±22.4 IL-6（pg/mg）146.5±30.7*373.0±52.2

2.3 兩組腸道隱窩干細(xì)胞增殖情況比較 實(shí)驗(yàn)組Ki-67、PCNA陽性細(xì)胞分別為（474.6±15.7）、（423.5±14.5）個(gè)，對照組分別為（408.6±14.8）、（388.7±13.8）個(gè)，實(shí)驗(yàn)組Ki-67、PCNA陽性細(xì)胞數(shù)量均多于對照組（P均＜0.05）。

2.4 兩組小腸上皮細(xì)胞凋亡情況比較 實(shí)驗(yàn)組小腸上皮細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)及Caspase-3、Bax蛋白相對表達(dá)量均低于對照組（P均＜0.05）。見表5。

表5 兩組小腸上皮細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)及Caspase-3、Bax相對表達(dá)量比較（±s）

表5 兩組小腸上皮細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)及Caspase-3、Bax相對表達(dá)量比較（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別實(shí)驗(yàn)組對照組Bax 0.69±0.11*1.82±0.37 n 15 15凋亡細(xì)胞數(shù)（個(gè)）74.6±13.8*123.9±24.2 Caspase-3 0.47±0.13*1.47±0.21

3 討論

當(dāng)意外暴露或接受高劑量放射治療時(shí)會導(dǎo)致急性放射綜合征的發(fā)生。小腸絨毛上皮細(xì)胞和隱窩干細(xì)胞對急性放射性損傷較為敏感，容易受到輻射損傷進(jìn)而造成GIS。GIS的主要表現(xiàn)包括胃腸道損傷引起的細(xì)菌性腸炎、吸收不良、腹瀉和體液丟失等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全。由于目前缺乏有效的醫(yī)學(xué)手段，尋找潛在的干預(yù)靶點(diǎn)是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

FBW7是具有7個(gè)串聯(lián)WD40重復(fù)序列的F-box蛋白。FBW7屬于E3復(fù)合體，其包含四個(gè)亞基，即Skp1、cullin1、Rbx1和F-box。FBW7是Skp1-Cul1-F-box-E3的關(guān)鍵底物識別亞基[9]。FBW7基因位于4q31.3并編碼三個(gè)亞型，分別為FBW7α、FBW7β和FBW7γ[10]。這三種蛋白具有相同的催化功能，但有不同的亞細(xì)胞定位。FBW7α主要位于細(xì)胞核，F(xiàn)BW7β 主要位于細(xì)胞質(zhì)，F(xiàn)BW7γ 則位于核仁[11]。這三個(gè)亞型在N端區(qū)域具有不同的氨基酸序列，但在C端均包含保守的相互作用區(qū)域，即F-box和WD40重復(fù)序列[12-13]。能夠被FBW7降解的靶蛋白均含有一個(gè)名為CDP的磷酸化氨基酸保守序列，CDP結(jié)合到WD40重復(fù)序列上，使泛素識別底物連接酶，從而使目的蛋白發(fā)生降解[13]。此外，在FBW7對底物發(fā)揮降解作用的過程中，糖原合酶3β（GSK3β）也起著至關(guān)重要的作用。GSK3β催化底物CDP中蘇氨酸磷酸化，促進(jìn)其與FBW7的結(jié)合并加速FBW7的降解[14]。

FBW7在腫瘤中的作用得到廣泛研究[6-7]，許多在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的分子均是其作用底物，如 c-Myc、Notch1、c-Jun[6]和 NF-κB[15-16]等。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BW7在炎癥性腸道疾病中發(fā)揮重要作用，因此推測FBW7可能也參與了放射誘導(dǎo)的GIS。為了明確FBW7在放射誘導(dǎo)GIS中的作用，我們課題組以腸上皮特異性敲除FBW7的小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，以野生型小鼠作為對照。放射性腸損傷嚴(yán)重程度的重要判斷標(biāo)準(zhǔn)之一是生存期，我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BW7腸道缺失可以提高放射后小鼠的生存時(shí)間。腹瀉情況和體質(zhì)量減輕也是放射性損傷的重要評價(jià)指標(biāo)，本研究中，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹瀉程度較對照組減輕。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量下降更為明顯，分析認(rèn)為是由于對照組從第8天開始就出現(xiàn)動物死亡，而實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量下降但并無死亡發(fā)生。我們還發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組腸道充血及水腫情況較對照組更輕，組織病理學(xué)評分更低，腸道絨毛長度及小腸隱窩深度減少程度也更小，以上結(jié)果提示，F(xiàn)BW7缺失能夠減輕放射引起的GIS。

炎癥反應(yīng)與放射性腸道損傷的嚴(yán)重程度和預(yù)后均有密切聯(lián)系。MPO富含于中性粒細(xì)胞中，其活性可反映炎癥嚴(yán)重程度。IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子也是炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組MPO活性及IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)降低，提示FBW7缺失有助于減輕GIS的腸道炎癥反應(yīng)，減輕相應(yīng)癥狀。

小鼠腸道細(xì)胞的增殖能力對于小鼠腸道損傷修復(fù)非常重要。當(dāng)小鼠腸道受到放射性損傷時(shí)，小鼠腸道細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)，則修復(fù)能力越強(qiáng)。而腸道細(xì)胞凋亡在GIS中有著非常重要的作用，是評估腸道損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。為探索FBW7發(fā)揮作用的機(jī)制，本課題組檢測了FBW7敲除后小腸上皮細(xì)胞的增殖和凋亡情況，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組腸道Ki-67、PCNA陽性細(xì)胞數(shù)多于對照組，說明實(shí)驗(yàn)組腸道細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，對放射性損傷的修復(fù)能力更強(qiáng)，而對照組腸道細(xì)胞凋亡情況更為嚴(yán)重，也是腸道損傷加重的關(guān)鍵因素。值得注意的是，我們觀察到的TUNEL陽性細(xì)胞大多數(shù)位于腸絨毛處，而腸道隱窩處較少，分析是由于TUNEL陽性細(xì)胞可能部分來自于腸道隱窩，當(dāng)腸道受到損傷時(shí)，腸道隱窩細(xì)胞發(fā)生增殖分化，然后轉(zhuǎn)移至腸道絨毛進(jìn)行修復(fù)，所以腸道絨毛細(xì)胞呈現(xiàn)TUNEL陽性。上述結(jié)果提示，F(xiàn)BW7缺失有可能通過抑制腸道細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖來減輕GIS。

然而，在放射損傷情況下，F(xiàn)BW7調(diào)控腸道細(xì)胞增殖和凋亡的具體機(jī)制并不十分明確。之前研究表明，p53在腸道細(xì)胞凋亡中起重要作用，能夠保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免于放射損傷[17]，而p53突變可能會降低FBW7表達(dá)[18]，這提示FBW7表達(dá)缺失可能通過調(diào)控p53信號通路來保護(hù)腸道，減輕放射損傷。此外，輻射可通過PI3K/Akt信號通路，調(diào)節(jié)mTOR表達(dá)，調(diào)控腸道細(xì)胞的自噬功能，從而調(diào)節(jié)放射損傷[19]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BW7的重要底物Notch1對PI3KAkt-mTOR信號通路有重要的調(diào)控作用[20]，推測這也可能是FBW7的作用機(jī)制。上述結(jié)果為FBW7具體調(diào)控機(jī)制相關(guān)研究提供了參考，有待進(jìn)一步深入探索。