褪黑素調(diào)控SIRT3對糖尿病腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織線粒體的保護作用

李亞男，劉戀，李冰玉，夏中元，趙博

武漢大學人民醫(yī)院麻醉科，武漢 430060

腦灌注恢復所誘發(fā)的腦缺血再灌注損傷（CIRI）一直是臨床治療中的難點[1]。糖尿病是CIRI預后不良的獨立危險因素之一[2]。新近研究證實，去乙?；?（SIRT3）主要在線粒體表達，是調(diào)控細胞氧化應(yīng)激、對抗損傷的關(guān)鍵[3]。SIRT3表達降低可導致肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[4]。研究表明，CIRI初期線粒體內(nèi)活性氧（ROS）大量產(chǎn)生，進而引起脂質(zhì)過氧化等一系列損傷反應(yīng)，而保護線粒體結(jié)構(gòu)和功能可顯著減輕損傷[5]。因此，通過調(diào)控SIRT3保護線粒體以減輕神經(jīng)元損傷已成為目前研究的焦點[6]。褪黑素主要在大腦中表達，發(fā)揮重要的神經(jīng)保護作用。還有研究者在胰島細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了褪黑素受體，提示褪黑素對糖脂代謝亦具有調(diào)控作用[7]，但具體機制尚未完全闡明。2020年1月—2021年12月，本研究觀察了褪黑素對糖尿病CIRI小鼠腦組織線粒體的保護作用，并基于SIRT3表達調(diào)控探討褪黑素的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 清潔級健康雄性C57BL/6小鼠24只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)條件：濕度65% ±5%、溫度（25±1）℃，光照周期（12 h光照/12 h黑暗）。鏈脲佐菌素（STZ）購自Sigma公司，褪黑素購自Sigma-Aldrich公司，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒及線粒體提取試劑盒購自南京建成公司，核呼吸因子1（NRF1）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）抗體購自Abcam公司，胞質(zhì)細胞色素C（Cyt-Cyto C）、3-TYP、β-actin、HRP標記的二抗購自CST公司。血糖儀購自強生公司，MCAO線栓購自Doccol公司，低溫高速離心機購自Thermo公司，電泳儀購自Bio-Rad公司，手術(shù)顯微鏡（鳳凰COX6100），Olympus倒置顯微鏡，Hitachi透射電鏡。

1.2 動物分組、造模及給藥方法 將24只小鼠隨機分為糖尿病假手術(shù)組（DS組）、糖尿病缺血再灌注組（DIR組）、糖尿病缺血再灌注+褪黑素組（DIR+Mel組）、糖尿病缺血再灌注+褪黑素+3-TYP組（DIR+Mel+3-TYP組）。4組小鼠均制作糖尿病模型：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，造模前禁食12 h，尾靜脈采血記錄空腹血糖，連續(xù)5 d腹腔注射1%的STZ 50 mg/kg，1周后尾靜脈測隨機血糖，當血糖值≥16.7 mmol/L并出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕癥狀，表明1型糖尿病模型制作成功。DIR組、DIR+Mel組、DIR+Mel+3-TYP組采用tMCAO法建立腦缺血再灌注模型：深度麻醉小鼠，消毒后頸部正中切口，顯微鏡下暴露左頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈；在頸總動脈上剪一小口，將頭端為硅樹脂涂層的6-0線栓由頸總動脈插入到頸內(nèi)動脈，遇到阻力后停止；缺血1 h后將線栓小心取出進行再灌注，逐層縫合傷口；DS組分離大腦中動脈但不阻斷血流；小鼠蘇醒后，觀察到小鼠出現(xiàn)以右前肢為重的偏癱時則認為模型構(gòu)建成功。DIR+Mel組、DIR+Mel+3-TYP組于缺血即刻和再灌注前腹腔注射褪黑素10 mg/kg。DIR+Mel+3-TYP組于tMCAO術(shù)前5、3、1 d分別腹腔注射SIRT3特異性抑制劑3-TYP 50 mg/kg。再灌注24 h后處死各組小鼠。

1.3 病灶腦組織線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 取1 mm3缺血半暗帶組織，用2.5%戊二醛固定24 h，磷酸緩沖液沖洗后再使用1%鋨酸-0.1 mol/L磷酸緩沖液固定2 h，梯度乙醇脫水，丙酮包埋滲透過夜，聚合48 h后制備超薄切片。鈾—鉛雙染干燥過夜，次日電鏡下觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.4 病灶腦組織線粒體氧化應(yīng)激水平及ATP含量檢測 取缺血半暗帶腦組織，應(yīng)用線粒體提取試劑盒分離胞質(zhì)與線粒體，-80℃保存?zhèn)溆谩０凑f明書操作測定MDA含量、SOD活性、CAT活性。將備用的線粒體依次加入底物液、促進劑和雙蒸水，混勻后37℃水浴并加入沉淀劑離心取上清，加入顯色劑靜置5 min后終止反應(yīng)。在636 nm下測定吸光度，計算ATP含量。

1.5 病灶腦組織線粒體生成因子NRF1、TFAM、Cyt-Cyto C檢測 取適量缺血半暗帶組織，加入裂解液后制備勻漿液，測定蛋白濃度。配置SDS-PAGE凝膠，加載樣品后在80 V下電泳。當溴酚藍指示劑到達濃縮膠與分離膠連接處，改用120 V恒定電壓分離后并轉(zhuǎn)膜。TBST封閉，加入NRF1、TFAM、Cyt-Cyto C（1∶1 000）一抗，4℃孵育過夜。次日加入相應(yīng)二抗孵育，顯影、定影后沖洗并掃描膠片。Band-Scan軟件分析膠片灰度值。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件統(tǒng)計。采用Shapiro-Wilk法進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠線粒體形態(tài)比較 與DS組相比，DIR組線粒體嚴重空泡化伴腫脹；與DIR組相比，DIR+Mel組線粒體空泡化和腫脹減輕；與DIR+Mel組相比，DIR+Mel+3-TYP組線粒體空泡化和腫脹加重。

2.2 各組小鼠病灶腦組織線粒體氧化應(yīng)激指標比較 見表1。

表1 各組小鼠病灶腦組織線粒體MDA含量、SOD活性、CAT活性比較（±s）

表1 各組小鼠病灶腦組織線粒體MDA含量、SOD活性、CAT活性比較（±s）

注：與DS組相比，aP＜0.05；與DIR組相比，bP＜0.05；與DIR+Mel組相比，cP＜0.05。

CAT活性（U/mg）8.32±0.98 3.45±0.71a 7.12±0.72b 4.12±0.57ac組別DS組DIR組DIR+Mel組DIR+Mel+3-TYP組n 6 6 6 6 MDA（nmol/mg）4.23±1.21 15.71±1.93a 8.56±1.47ab 13.09±1.62abc SOD活性（U/mg）141.95±15.47 49.53±11.60a 108.19±18.15ab 80.26±14.81abc

2.3 各組小鼠病灶腦組織線粒體ATP含量及線粒體生成因子表達比較 見表2。

表2 各組小鼠病灶腦組織線粒體ATP含量及NRF1、TFAM、Cyt-Cyto C表達比較（±s）

表2 各組小鼠病灶腦組織線粒體ATP含量及NRF1、TFAM、Cyt-Cyto C表達比較（±s）

注：與DS組相比，aP＜0.05；與DIR組相比，bP＜0.05；與DIR+Mel組相比，cP＜0.05。

組別DS組DIR組DIR+Mel組DIR+Mel+3-TYP組Cyt-Cyto C 1.00±0.21 2.23±0.32a 1.47±0.24ab 1.93±0.29ac n 6 6 6 6 ATP含量95.57±13.67 44.61±10.10a 75.76±11.43ab 54.60±11.06ac NRF1 1.00±0.14 0.40±0.11a 0.75±0.12ab 0.51±0.17ac TFAM 1.00±0.15 0.44±0.13a 0.77±0.11ab 0.54±0.16ac

3 討論

糖尿病是缺血性腦卒中重要且獨立的危險因素。對于血糖控制不佳的糖尿病患者，其心臟病和缺血性腦卒中的發(fā)生風險均顯著升高，因此有學者認為血糖水平可作為衡量糖尿病患者心腦血管疾病發(fā)生風險的重要預測指標之一[8]。流行病學資料顯示，1型糖尿病患者缺血性腦卒中的發(fā)生率遠高于2型糖尿病患者，且1型糖尿病合并缺血性腦卒中患者腦損傷程度更加嚴重[9]。同時，臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者嚴格的血糖控制并不能有效降低缺血性腦卒中的發(fā)生風險，也未能有效延緩缺血性腦卒中的進展，一些有益于非糖尿病CIRI患者的救治策略用于糖尿病CIRI患者效果也并不理想[10]。

研究表明，高糖可加重CIRI，同時影響藥物等各種干預措施對CIRI的治療作用[11]。近年來，線粒體作為神經(jīng)退行性疾病的主要治療靶點受到越來越多的關(guān)注。線粒體作為“能量中樞”，是具有獨特組織特異性的動態(tài)多功能細胞器，參與神經(jīng)可塑性及神經(jīng)元凋亡等過程[12]。同時線粒體也是細胞內(nèi)ROS的主要來源，對各類應(yīng)激反應(yīng)均十分敏感，一旦氧化應(yīng)激失衡，可導致線粒體損傷并形成惡性循環(huán)[13]。與其他細胞相比，神經(jīng)元需要消耗更多的能量，但儲備卻十分匱乏。若發(fā)生CIRI，神經(jīng)元能量產(chǎn)生所需底物會被迅速耗盡進而誘發(fā)線粒體損傷[14]。有證據(jù)表明，再灌注期間由于線粒體損傷，眾多促生存的級聯(lián)反應(yīng)被抑制，進而導致缺血神經(jīng)元損傷加重[15]。因此，維護線粒體形態(tài)和功能正常是糖尿病CIRI的潛在治療策略。

Sirtuins蛋白家族是一群保守的Ⅲ類組蛋白去乙?；福℉DACs），其可通過調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子、酶和蛋白質(zhì)，在基因轉(zhuǎn)錄、基因組穩(wěn)定性、糖脂代謝和壽命調(diào)控等過程中發(fā)揮重要作用[16]。SIRT3作為線粒體Sirtuins的主要亞型，近年來備受研究者的重視。SIRT3通過調(diào)節(jié)線粒體氧化應(yīng)激水平，在細胞內(nèi)脂肪酸氧化和ATP合成中發(fā)揮重要作用[17]。新近研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3作為調(diào)控氧化應(yīng)激和維持能量穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，抑制SIRT3可導致線粒體運輸障礙，ROS增多，能量匱乏，再灌注損傷加重；激活SIRT3可增加線粒體生成，加快ROS清除，是機體內(nèi)源性保護的關(guān)鍵[18]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病CIRI后線粒體出現(xiàn)嚴重空泡化和腫脹，同時線粒體MDA水平增加，SOD、CAT活性降低，ATP含量減少，線粒體生成因子NRF1、TFAM表達降低，Cyt-Cyto C表達升高，提示線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損、線粒體生成障礙是糖尿病CIRI加重的關(guān)鍵機制之一。

褪黑素作為一種內(nèi)源性的吲哚胺分子，主要由松果體合成。褪黑素的合成和分泌隨著年齡增長而減少，其相對缺乏可能與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[19]。褪黑素缺乏的大鼠在腦卒中后表現(xiàn)出更嚴重的腦損傷或興奮性毒性癲癇發(fā)作[20]。研究表明，褪黑素在非糖尿病CIRI中具有神經(jīng)保護作用[21]。新近研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素亦可在包括糖尿病在內(nèi)的各種病理條件下維持線粒體穩(wěn)態(tài)，保護線粒體免受損傷[22]。本研究結(jié)果顯示，在再灌注之前給予褪黑素治療可維持線粒體形態(tài)，降低線粒體氧化應(yīng)激水平，增加ATP供能，同時促進線粒體生成，進而顯著減輕神經(jīng)損傷。當特異性抑制SIRT3后，上述神經(jīng)保護功能被削弱。這提示褪黑素可能通過激活SIRT3，介導線粒體保護，進而減輕糖尿病CIRI。

綜上所述，褪黑素干預可維持糖尿病CIRI小鼠線粒體正常形態(tài)，降低線粒體氧化應(yīng)激水平，增加ATP含量，促進線粒體生成，作用可能與調(diào)控SIRT3表達有關(guān)。