熒光定量PCR 檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中結(jié)核菌DNA 對(duì)肺結(jié)核診斷的分析

徐露露

(南京市第二醫(yī)院，江蘇 南京 210000)

0 引言

作為常見的一種傳染性疾病，肺結(jié)核的發(fā)生與結(jié)核分歧桿菌感染有關(guān)，多見于糖尿病、老年人及HIV 感染患者，目前結(jié)核病是HIV 患者常見的機(jī)會(huì)性感染、最主要的死亡原因[1]。調(diào)查顯示，全球HIV 與結(jié)核分枝桿菌雙重感染患者數(shù)量呈不斷增長(zhǎng)趨勢(shì)發(fā)展。WTO 指出，2014 年肺結(jié)核患病數(shù)量為960 萬(wàn)例，其中并發(fā)HIV 感染數(shù)量為120 萬(wàn)例，損害人體健康，危及生命。所以，積極診治肺結(jié)核具有重要的臨床意義[2]。關(guān)于肺結(jié)核的診斷，以往采用病原學(xué)檢查方法，如涂片法、培養(yǎng)法，二者雖然能夠取得一定的檢測(cè)效果，但是涂片法檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率較低，而培養(yǎng)法檢測(cè)用時(shí)較長(zhǎng)，加上大部分肺結(jié)核患者缺乏特異性表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)特征性不明顯，所以仍會(huì)有部分患者出現(xiàn)誤診、漏診現(xiàn)象，造成病情延誤治療[3]。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Realtime PCR)得以提出。實(shí)時(shí)熒光定量PCR，是一種在DNA 擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法[4]?；谂R床實(shí)踐，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)具有敏感度高、特異性高、耗時(shí)短等特點(diǎn)，在多個(gè)領(lǐng)域中均取得較高的檢測(cè)效果，尤其是可1~100fg 純化的結(jié)核桿菌DNA，相當(dāng)于1~20 個(gè)結(jié)核桿菌。支氣管肺泡灌洗術(shù)是用于治療肺結(jié)核的常用方法，而當(dāng)中的支氣管肺泡灌洗液細(xì)菌含量較高，經(jīng)熒光定量PCR 檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中的DNA，即可為肺結(jié)核的診斷提供重要的輔助價(jià)值。為此，本研究針對(duì)我院54 例疑似肺結(jié)核患者開展研究，探究熒光定量PCR 檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中結(jié)核菌DNA 的價(jià)值，具體報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)神志清楚，可正常交流、書寫、溝通等；(2)首次進(jìn)行支氣管肺泡灌洗；(3)對(duì)研究的內(nèi)容及目的、臨床意義已知曉，自愿參與。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)認(rèn)知障礙；(2)合并影響研究順利開展的疾病，如心理疾患、肝腎功能不全、占位性病變、凝血功能障礙等；(3)存在支氣管肺泡灌洗禁忌癥；(4)研究過(guò)程中因自身原因而主動(dòng)退出。

結(jié)合研究篩選條件(入選標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn))，選取南京市第二醫(yī)院2019 年4 月至2021 年4 月期間納入54 例疑似肺結(jié)核患者為研究對(duì)象，包括男患者34 例、女患者20 例，年齡為37~70 歲，平均為(52.39±12.17)歲。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 檢測(cè)前

患者入院后，與其進(jìn)行介紹疾病知識(shí)，詳細(xì)介紹涂片法、支氣管肺泡灌洗(目的、方法和要求及配合事項(xiàng)、該方法的有效性、安全性等)、熒光定量PCR 檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中結(jié)核菌DNA 等相關(guān)知識(shí)，并耐心解答患者提出的問題，以取得患者的理解、配合，促進(jìn)各項(xiàng)檢查順利進(jìn)行。安排同一組臨床工作經(jīng)驗(yàn)較豐富的醫(yī)生進(jìn)行所有操作。ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、高速冷凍離心機(jī)(ThermoFisher 公司)、結(jié)核分枝桿菌DNA 試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因公司)。

1.2.2 檢測(cè)中

涂片法檢測(cè)，如下：(1)采集患者清晨深呼吸后咳出的痰液，或是使用用咽拭子取出肺部深入分泌物，立即將痰標(biāo)本送檢；(2)進(jìn)行改良齊-尼氏抗酸染色，在顯微鏡觀察，如若300 個(gè)視野可見超過(guò)3條以上的抗酸桿菌，即可判斷陽(yáng)性。

熒光定量PCR 檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中結(jié)核菌DNA，如下：(1)對(duì)患者進(jìn)行常規(guī)檢查，包括支氣管鏡檢查、胸部CT 檢查等，如若見到異常/相關(guān)病灶，則會(huì)對(duì)應(yīng)的葉段支氣管進(jìn)行灌洗，即完善術(shù)前相關(guān)檢查(凝血四項(xiàng)、血常規(guī)、血?dú)夥治?、肺功能、心電圖等)，同時(shí)指導(dǎo)患者進(jìn)行有效咳嗽、肺功能鍛煉，以利于灌洗后肺功能的恢復(fù)、肺部分泌物的排；術(shù)前4h 禁食水，之后參照支氣管肺泡灌洗術(shù)操作流程完成所有操作；(2)選擇無(wú)菌灌洗液瓶為工具，收集20mL 支氣管肺泡灌洗液，封并立即送檢，從中取5mL 支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行離心處理(時(shí)間5min、速度為12000rpm)，對(duì)沉淀物加入0.9%氯化鈉注射液1mL，充分混勻，繼續(xù)進(jìn)行高速離心，確保沉淀物、50μL DNA 提取液充分混合，最后將其置于恒溫100℃溫箱內(nèi)10min，4℃冰箱內(nèi)冷卻至室溫，再次離心處理，留取上清，加入PCR 反應(yīng)管內(nèi)，進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，如檢測(cè)值≥500 拷貝/mL，視為陽(yáng)性；檢測(cè)值＜500 拷貝/mL，視為陰性；(3)所有操作均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.3 檢測(cè)后

由同一組醫(yī)生給出最終結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 結(jié)核桿菌培養(yǎng)法檢出情況

對(duì)患者結(jié)核桿菌培養(yǎng)法檢出情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.2 兩種檢測(cè)方法的診斷效果差異對(duì)比

以結(jié)核桿菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比兩種檢測(cè)方法診斷效果差異，包括敏感度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值

敏感度=真陽(yáng)性人數(shù)/(真陽(yáng)性人數(shù)+假陰性人數(shù))×100%；

特異性=真陰性人數(shù)/(真陰性人數(shù)+假陽(yáng)性人數(shù))×100%；

陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性人數(shù)/(真陽(yáng)性人數(shù)+假陽(yáng)性人數(shù))×100%；

陰性預(yù)測(cè)值=真陰性人數(shù)/(假陰性人數(shù)+真陰性人數(shù))×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核桿菌培養(yǎng)法檢出結(jié)果的具體分析

共54 例疑似肺結(jié)核患者，經(jīng)結(jié)核桿菌培養(yǎng)法確診出54 例肺結(jié)核。

2.2 對(duì)比兩種檢測(cè)方法的診斷效果差異

對(duì)兩種檢測(cè)方法的診斷效果差異進(jìn)行比較(見表1、表2、表3)：B 組診斷準(zhǔn)確性、敏感度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均明顯高于A 組，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 痰涂片檢測(cè)結(jié)果(例)

表2 熒光定量PCR 檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中結(jié)核菌DNA(例)

表3 對(duì)比兩種檢測(cè)方法的診斷效果差異(%)

3 討論

結(jié)核病是目前嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。結(jié)核病以肺結(jié)核為主，是嚴(yán)重危害人民群眾身體健康的重大傳染病之一?！丁笆濉比珖?guó)結(jié)核病防治規(guī)劃》指出，到2020 年我國(guó)肺結(jié)核發(fā)病率已降到58/10 萬(wàn)以下，尤其是疫情偏高地區(qū)的肺結(jié)核發(fā)病率較2015 年下降20%。由此可見，我國(guó)結(jié)核病疫情呈逐年下降趨勢(shì)發(fā)展，發(fā)現(xiàn)、治療管理活動(dòng)性肺結(jié)核患者數(shù)量為427 萬(wàn)例，成功治療率保持在85%以上，肺結(jié)核報(bào)告發(fā)病率、死亡率均下降，基本實(shí)現(xiàn)了“十二五”規(guī)劃目標(biāo)。值得注意的是，我國(guó)結(jié)核病防治工作仍面臨諸多問題、挑戰(zhàn)。目前，我國(guó)仍是全球30 個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，尤其是中西部地區(qū)、農(nóng)村地區(qū)的結(jié)核病防治形勢(shì)嚴(yán)峻。為了減輕患者精神壓力、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，避免因病致貧、因病返貧，應(yīng)提高患者門診就診檢查水平。

肺結(jié)核的發(fā)生，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)低熱、盜汗、乏力、納差及咳嗽、胸痛、不同程度呼吸困難等癥狀，甚至造成咯血等并發(fā)癥，危及患者健康安全[5]?；谂R床實(shí)踐，從肺結(jié)核患者的痰液、肺泡灌洗液等找到結(jié)核分枝桿菌是診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性檢出率低下、檢測(cè)對(duì)組織創(chuàng)傷大、費(fèi)用高等一系列問題給肺結(jié)核診斷帶來(lái)一定影響。所以，快速尋找準(zhǔn)確的肺結(jié)核診斷方法已成為對(duì)當(dāng)前研究重點(diǎn)。

熒光定量PCR 技術(shù)，是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)全部過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。因該技術(shù)的特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為目前分子生物學(xué)技術(shù)中的重要工具。隨著當(dāng)前分子生物學(xué)的快速發(fā)展，熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)在肺結(jié)核診斷中受到廣泛運(yùn)用。熒光定量PCR 技術(shù)具有高敏感性、高準(zhǔn)確性，定量范圍廣、操作簡(jiǎn)便、快速安全等特點(diǎn)，是用于放大擴(kuò)增特定的DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)。結(jié)合臨床實(shí)踐，該技術(shù)可檢測(cè)痰標(biāo)本、外周血及肺泡灌洗液，尤其是對(duì)于無(wú)空洞型、病變范圍較少的含菌量低的標(biāo)本，原因?yàn)榉闻莨嘞匆旱牟牧现饕x擇遠(yuǎn)端氣道、肺泡腔，接觸病灶的范圍較廣，所以細(xì)菌含量高，污染率低，加上灌洗操作能夠有效刺激患者咳嗽，以促進(jìn)局部支氣管分泌物的引流。因此，認(rèn)為準(zhǔn)確檢測(cè)出肺結(jié)核支氣管氣泡灌洗液中結(jié)核菌DNA，便于早期識(shí)別干預(yù)。曹秀廷[5]等人選擇活動(dòng)性肺結(jié)核患者、潛伏性肺結(jié)核患者開展研究，探究外周血、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中Vδ2~+ T 淋巴細(xì)胞比例的臨床意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者外周血Vδ2~+ T 淋巴細(xì)胞比例呈下降趨勢(shì)發(fā)展，考慮與調(diào)節(jié)血清IL-4、IL-10水平，促進(jìn)肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。唐神結(jié)[6]等人同樣對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核、非活動(dòng)性肺結(jié)核患者開展研究，探究肺結(jié)核患者支氣管肺泡灌洗液中T 淋巴細(xì)胞亞群的特點(diǎn)及意義，發(fā)現(xiàn)結(jié)合該患者的支氣管肺泡灌洗液、外周血中T 淋巴細(xì)胞亞群比例，即可判斷患者試劑病情狀況，以指導(dǎo)醫(yī)生制定合理的治療方案，該患者病情，促進(jìn)預(yù)后轉(zhuǎn)歸?？锪种7]等人針對(duì)肺結(jié)核患兒、肺部疾病患兒為例，探究熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)測(cè)定支氣管肺泡灌洗液中TbDNA 的價(jià)值，發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)的敏感度較于痰涂片抗酸染色鏡檢、纖支鏡痰涂片抗酸染色鏡檢高，但熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)、痰涂片抗酸染色鏡檢、纖支鏡痰涂片抗酸染色鏡檢的診斷特異度無(wú)差異，提示熒光定量PCR 檢測(cè)BALF中的TbDNA 價(jià)值較高，可充分體現(xiàn)出快速、敏感度高、特異度高等特點(diǎn)，以利于早期診斷肺結(jié)核，特別是痰涂片呈陰性、無(wú)典型影像學(xué)特征的肺結(jié)核患兒。劉金榮[8]等人肺炎支原體患者開展研究，比較咽拭子標(biāo)本、支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本的檢測(cè)價(jià)值效果，發(fā)現(xiàn)咽拭子可作為MP 熒光PCR 定性檢測(cè)標(biāo)本，但不適用于MP 的定量研究，表示咽拭子的MP核酸載量、BALF 中載量無(wú)相關(guān)性，而支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本較咽拭子標(biāo)本而言，污染率低，培養(yǎng)率高，可作為MP 分離培養(yǎng)研究的首選培養(yǎng)方法。結(jié)合上述分析，認(rèn)為重點(diǎn)分析熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)診斷肺結(jié)核的敏感性、特異性較高。

本研究結(jié)果顯示，B 組診斷準(zhǔn)確性90.74%、敏感度85.71%、特異度93.94%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值90.0%、陰 性 預(yù) 測(cè) 值91.18% 均 較A 組68.52%、57.14%、75.76%、60.0%、73.53% 高，說(shuō)明熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)對(duì)肺結(jié)核的診斷敏感性、特異性較高，能夠?yàn)槠浜罄m(xù)治療決策提供重要依據(jù)。而假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生考慮和以下原因有關(guān)：標(biāo)本間的污染、標(biāo)本對(duì)試劑的污染；熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)難以區(qū)分死菌、活菌，所以部分非結(jié)核感染病灶、陳舊結(jié)核灶中可能出現(xiàn)假陽(yáng)性；擴(kuò)增潛伏感染的結(jié)核分枝桿菌。

綜上所述，灌洗技術(shù)有利于局部支氣管分泌物的引流，對(duì)肺結(jié)核特別是影像學(xué)特征不典型及痰涂片檢查陰性的患者，是一種可以提高確診率的有效方法，可作為診斷肺結(jié)核的主要依據(jù)指標(biāo)，以及協(xié)助肺結(jié)核的早期診斷，為此采用熒光定量PCR 方法檢測(cè)支氣管氣泡灌洗液中結(jié)核菌DNA，以獲取較高的價(jià)值效果，指導(dǎo)治療肺結(jié)核，提高臨床效果，改善患者臨床結(jié)局，促進(jìn)預(yù)后恢復(fù)，值得在今后工作中進(jìn)行大力宣傳、推廣。介于相關(guān)報(bào)道較少，本次研究樣本量不足等方面的局限性，今后仍需繼續(xù)探究光定量PCR 方法檢測(cè)支氣管氣泡灌洗液中結(jié)核菌DNA 的價(jià)值效果，以期豐富研究成果，為其他研究的順利開展提供依據(jù)，以及不斷提升我國(guó)肺結(jié)核患者診斷發(fā)展水平。