小細胞肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs 的生物信息學(xué)分析

劉蓉，劉敏

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

0 引言

肺癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC) 占 肺 癌 的15%，生長迅速，惡性程度高預(yù)后差，早期即可出現(xiàn)廣泛的遠處轉(zhuǎn)移，患者的5 年生存率不足10%[1-2]。廣泛期轉(zhuǎn)移是SCLC 患者預(yù)后差的主要原因，而研究顯示60%-80%的患者在確診時即為廣泛期[3]。miRNAs 是長約18-25 個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，與靶基因的3'-非編碼區(qū)(untranslation regions，UTR)結(jié)合調(diào)控基因表達[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，異常表達的miRNAs 與肺癌腫瘤細胞的黏附、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5-6]。同時，miRNAs 在腫瘤組織及血清中較穩(wěn)定，使其在早期SCLC 診斷、治療及預(yù)后判斷中具有較高的探索價值[7]。

基因芯片是一種快速有效的檢測miRNAs 表達譜的技術(shù)，本研究利用基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件Qlucore Omics Explorer 3.0 對來自GEO 數(shù)據(jù)庫的SCLC 轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)進行分析：篩選差異表達miRNAs，并運用生物信息學(xué)技術(shù)初步分析差異性miRNAs 調(diào)控SCLC 轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號通路、下游靶基因及蛋白，以從整體上了解SCLC 轉(zhuǎn)移過程中整個基因組及信號通路的變化，為早期診斷、治療SCLC 尋找到相關(guān)生物標志物提供生物信息學(xué)參考，從而為腫瘤防治提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 基因表達數(shù)據(jù)

在GEO Datasets 數(shù)據(jù)庫檢索框中輸入“small cell lung cancer AND metastasis”，獲 得 由Zhou R等提交的芯片數(shù)據(jù)。實驗設(shè)計采用廣泛期小細胞肺癌(Extensive Disease-SCLC，ED)患者和局限期小細胞肺癌(Limited Disease-SCLC，LD)患者各3例的血清樣本。

1.2 差異miRNAs 的篩選及靶基因預(yù)測

先將GEO Datasets 數(shù)據(jù)庫中獲取的數(shù)據(jù)輸入至Qlucore Omics Explorer 3.0 在線分析軟件，再對數(shù)據(jù)進行分析。采用兩組樣本t 檢驗，通過對數(shù)據(jù)的過濾，篩選出差異表達的miRNAs。利用TargetScan 7.1，miRDB，miRWalk 數(shù)據(jù)庫對差異miRNAs 進行的靶基因預(yù)測，并取交集。

1.3 GO 功能分析和KEGG 通路分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/home. jsp)進行GO(Gene Ontology)功能分析及KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，P＜0.05 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 STRING 蛋白互作分析

聯(lián)合使用STRING11.0(https：//stringdb.org/)和Cytoscape 3.6.1 在線分析工具進行靶基因編碼蛋白的互作分析。

2 結(jié)果

2.1 ED-SCLC 和LD-SCLC 患者血清中差異表達的miRNAs

以|Fold change| ≥2 和P＜0.05 作 為 選 擇 標準，對差異表達的miRNAs 進行篩選。ED-SCLC組與LD-SCLC 組比較，共篩選出了21 個差異miRNAs(圖1)。并預(yù)測出836 個靶基因。

圖1 差異表達miRNAs 聚類分析 紅色:上調(diào)基因; 綠色:下調(diào)基因

2.2 GO 富集分析

GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，靶基因共參與多種生物過程。如上調(diào)RNA 聚合酶Ⅱ啟動子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合與激活、細胞連接、DNA 模板的轉(zhuǎn)錄及結(jié)合、上調(diào)轉(zhuǎn)錄以及細胞內(nèi)受體信號通路等生物學(xué)過程(圖2)。

圖2 GO 富集分析

2.3 KEGG 通路富集分析

KEGG 通路分析可用于評估差異表達的信號通路，包括腫瘤通路、Ras、Rap1、PI3K-Akt 信號通路以及調(diào)節(jié)多能干細胞等信號通路。

2.4 靶蛋白間的相互作用

利用STRING11.0 和Cytoscape 3.6.1 在線分析軟件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(圖3)。通過差異miRNA靶基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，最終得到STAT3、SMAD3、MAPK9、E2F1、MMP2、AKT2 為網(wǎng)絡(luò)的中心蛋白。

圖3 靶蛋白互作圖

3 討論

惡性腫瘤早期準確的診斷是醫(yī)學(xué)所關(guān)注的熱點。SCLC 是一種具有高度侵襲性，早期即可經(jīng)血液、淋巴結(jié)發(fā)生多器官轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，其容易發(fā)生轉(zhuǎn)移的確切機制目前仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 可調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、侵襲能力和遷移等[8]。并且與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、遷移及預(yù)后密切相關(guān)[9]。因此，作為轉(zhuǎn)移能力強的SCLC，深入研究SCLC 轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNAs，并探討其在SCLC 侵襲遷移中的分子機制，對于為SCLC 早期診療提供新的線索具有重要意義。

本研究通過對芯片數(shù)據(jù)的分析，共篩選出21個下調(diào)差異miRNAs。研究表明，McCubrey 等[10]研究發(fā)現(xiàn)Ras 通路參與多種腫瘤的發(fā)展與遷移，并發(fā)生了Ras 突變。Ras 相關(guān)蛋白1(Rap1) 是RAS家族中的一員，可通過PI3K/Akt 等多種信號通路，促進腫瘤細胞增殖、內(nèi)皮細胞遷移，免疫逃逸等癌變過程[11]。PI3K/Akt 通路在參與細胞生長、分化和應(yīng)激中扮演重要角色，誘導(dǎo)腫瘤細胞的侵襲和遷移能力增強[12]。PI3K/Akt 通路的激活可促進小細胞肺癌干細胞惡性增殖和定向分化[13]。

研究表明，STAT3 的激活、增強了SMAD3 的表達，增加了肺腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。MAPKs在惡性腫瘤的發(fā)展中起重要作用，可調(diào)節(jié)細胞增殖 和 凋 亡[15]。FGFR 能 激 活STAT3、PI3K/Akt 和MAPK 級聯(lián)反應(yīng)，其生物過程涉及細胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移。其基因突變、過表達等異常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與一些腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。在SCLC 中E2F1 升高并參與了腫瘤細胞粘附、侵襲及擴散，同時激活SP1 和NF-κ B[17-18]。從而調(diào)控MMPs 的表達促進腫瘤細胞的侵襲遷移功能[19]。Akt2 的活性受PI3K 調(diào)控，在多種腫瘤細胞中處于活躍狀態(tài)，在腫瘤的惡性增殖、侵襲、耐藥以及免疫逃逸方面發(fā)揮重要功能[20]。

本研究利用SCLC 轉(zhuǎn)移相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)的挖掘，篩選出21 個差異表達miRNAs，差異基因預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ras、PI3K/Akt 通路以及STAT3、SMAD3、MAPK9、E2F1、MMP2 和AKT2 基因可能在SCLC 轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。上述結(jié)論為闡明SCLC 轉(zhuǎn)移發(fā)生的分子機制提供了理論支持，為SCLC 的診斷及治療提供了新思路。